Şanlıurfa’da Satışa Sunulan Yoğurtlarda Lactobacillus spp.’lerin qPCR Miktarlarının Belirlenmesi
Yoğurt; geleneksel süt fermentasyonunda büyük bir rol oynayan ve probiyotik etkinlikleri olan bakterileri içermesi nedeniyle hayatımıza sağlık katan en önemli besin maddelerinden biridir. Günümüzde oldukça fazla tüketilen probiyotiklerin; yoğurtlardaki miktarlarının artması veya azalması ve mikrobiyolojik kalitelerinin tespiti halk sağlığı açısından irdelenmesi gerekmektedir. Bu çalışmada, Şanlıurfa ili ve çevre ilçelerinde satışa sunulan yoğurtlarda; probiyotik olarak önemi sıkça bildirilen Lactobacillus spp.’lerin (LAB) qPCR metodu ile tanımlanarak, kantitatif olarak miktar analizinin yapılması amaçlanmıştır. Yoğurt örneklerinden direk izolasyon ile elde edilen DNA’lardan Lactobacillus spp.’nin qPCR ile tespiti için; Lactobacillus spp. 16S-23S ribosomal RNA Intergenic Spacer Region (ISR) gen bölgesine spesifik primerler kullanılmıştır. Real-time PCR ile yapılan analizler sonucunda, 14 ile 32 aralığında Ct saptanmıştır ve kantitatif analizin hassasiyetini korumak için, miktarları belli plazmid standart kullanarak 102 ile 108 CFU/g arasında standart eğri elde edildi ve real-time PCR analizlerinde kantitasyon bu eğri ile gerçekleştirilmiştir. Bu sayede alt limit olarak 102 CFU/g gibi hassas bir alt limit belirlenmiştir. Sonuçlar, Lactobacillus spp. insan sağlığı açısından değerli, probiyotik bakterilerin, bölgemizde satışa sunulan ev yapımı yoğurtlarda daha düşük düzeyde bulunduğunu, bölgemizdeki bu yoğurtların, tüketime olgunlaşma süreci tamamlanmadan sunuluyor olabileceğini, bu ürünlerin üretim sürecinde dikkat edilmesi gerektiği tespit edilmiştir. Ayrıca sonuçlar, ülkemizde ilk kez klasik mikrobiyolojik yöntemler yerine, real-time PCR yönteminin insan sağlığı açısından probiyotik önemleri olan Lactobacillus spp.’lerin miktar analizlerinde hızlı, hassas ve güvenilir olarak tespiti için kullanılabilecek bir yöntem olduğunu göstermiştir.
___
- 1. Coeuret V, Dubernet S, Bernardeau, M, Gueguen M, Vernoux
J.P, (2003). Isolation, characterisation and identification of lactobacilli
focusing mainly on cheeses and other dairy products.
Le Lait, INRA Editions. 83, 269-306.
- 2. Demirkaya AK, Gökalp Z (2013). Bilecik’te Tüketime
Sunulan Yoğurtların Kimyasal ve Mikrobiyolojik Kalitesinin
Araştırılması. Atatürk Ünv Vet. Bil. Derg. 8(3), 202-209.
- 3. EC (2007) Corrigendum to Regulation (EC) No 1924/2006 of
the European Parliament and of the Council of 20 December
2006 on nutrition and health claims made on foods (Official
Journal of the European Union L 404 of 30 December 2006).
Off J Eur Union L12, 3-18.
- 4. Erdoğrul Ö, Erbilir F, (2006). Isolation and Characterization of
Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus casei from Various
Foods. Turk J Biol. 30, 39-44.
- 5 Ertaş N, Serhat A, Karadal F, Gönülalan Z, (2014). Kayseri İlinde
Satışa Sunulan Manda Yoğurtlarının Mikrobiyolojik Kalitesi.
İstanbul Ünv Vet Fak Derg. 40 (1), 83-89.
- 6. Furet JP, Quennee P, Tailliez PP, (2004). Molecular quantification
of lactic acid bacteria in fermented milk products using
real-time quantitative PCR. Int J Food Microbiol. 97, 197-207.
- 7. Galanis A, Kourkoutas Y, Tassou CC, Chorianopoulos N, (2015).
Detection and Identification of Probiotic Lactobacillus plantarum
Strains by Multiplex PCR Using RAPD-Derived Primers.
Int J Mol Sci. 16(10), 25141-53.
- 8. García-Albiach R, María J, Pozuelo D, Santiago A, María-Isabel
M, Daniel B, Fernando B, Rosa C, (2008). Molecular analysis
of yoğurt containing Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
and Streptococcus thermophilus in human intestinal microbiota.
Am J Clin Nutr 87-91-6.
- 9. Gianluca B, Lucia R, Franco D, Sandra T, (2003). Development
of Reverse Transcription (RT)-PCR and Real-TimeRT-PCR
Assays for Rapid Detection and Quantification of Viable Yeasts
and Molds Contaminating Yogurts and Pasteurized Food
Products. Appl Environ Microbiol. Jul;69(7):4116-22.
- 10. Herbel SR, Lauzat B, Von Nickisch-Rosenegk M, Kuhn M,
Murugaiyan J, Wieler LH, Guenther S, (2013). Species-specific
quantification of probiotic lactobacilli in yoghurt by quantitative
real-time PCR. J Appl Microbiol. 115, (6) 1402-1410.
- 11. Kandler O, Weiss N, (1984). Genus Lactobacillus, in: Sneath
P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt JG, (Eds.), Bergey’s
Manual of Systematics Bacteriology, Williams and Wilkins,
Baltimore M.D., USA, pp. 1209-1234.
- 12. Keleş F, (2003). Konya yöresi taze ev yapımı yoğurtların mikrobiyolojik
özelliklerinin araştırılması. Yüksek Lisans Tezi,
SÜ Fen Bilimleri Enstitüsü, Konya.
- 13. Kwon HS, Yang EH, Yeon SW, Kang BH, Kim TY, (2004).
Rapid identification of probiotic Lactobacillus species by
multiplex PCR using species-specific primers based on the
region extending from 16S rRNA through 23S rRNA. FEMS
Microbiol Lett, 239, 267-275.
- 14. Maier S, Olek A, (2002). Diabetes: a candidate disease for efficient
DNA methylation profiling. J Nutr 132, 2440-2443.
- 15. Margolles A, Mayo B, Ruas-Madiedo P, (2009). Screening,
identification, and characterization of Lactobacillus and
Bifidobacterium strains. In Handbook of probiotics and prebiotics
ed. Nomoto, K., Salminen, S. and Lee, Y.K. p. 15.
Hoboken, NJ: John, Wiley & Sons, Inc.
- 16. Rinttilä T, Kassinen A, Malinen E, Krogius L, Palva A, (2004).
Development of an extensive set of 16S rDNA-targeted primers
for quantification of pathogenic and indigenous bacteria
in faecal samples by real-time PCR. J Appl Microbiol. 97(6),
1166-77.
- 17. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, (1989). Molecular cloning:
a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Press,
New York.
- 18. Udo F, Jan L, (2006). Improved Enumeration of Lactic Acid
Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using
Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-
Fluorescence In Situ Hybridization. Appl Environ Microbiol.,
72(6), 4163-4171
- 19. Sömer VS, (2010). Dayanıklı Yoğurtların Mikrobiyolojik
Fizikokimyasal Özelliklerinin ve Biyojen amin içeriklerinin
belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, MAE Ünv. Fen bilimleri
Enstitüsü, Burdur.
- 20. Zamfir M, Vancanneyt M, Makras L, Vaningelgem F, Lefebvre
K, Pot B, Swings J, De Vuyst L, (2006). Biodiversity of lactic
acid bacteria in Romanian dairy products. Syst Appl Microbiol,
29(6):487-95.
- 21. Zhang ZG, Ye ZQ, Yu L, Shi P, (2011). Phylogenomic reconstruction
of lactic acid bacteria: an update. BMC Evol B