Yanhua XU, Zhichen WANG, Yongjun DONG, Lirong WANG, Yu ZHANG, Nan YU, Hailin LIU

Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis ve Pasteurella multocida’nın Saptanmasında SYBR Green I Multiple Gerçek Zamanlı Floresan PCR Yönteminin Geliştirilmesi

Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis ve Pasteurelle multocida, domuz yetiştiriciliğinde yaygın solunum sistemi hastalıkları patojenleridir ve domuz endüstrisinde sekonder enfeksiyonlara ve ciddi ekonomik kayıplara neden olabilirler. Bu üç patojenin neden olduğu klinik semptomların çıplak gözle ayırt edilmesi güçtür ve miks enfeksiyonlar hastalıkların tanısını zorlaştırır. Bu çalışmada, A. pleuropneumoniae Apx IV, H. parasuis Omp P2 ve P. multocida PlpE gen bazında spesifik primerler tasarlandı. A. pleuropneumoniae, H. parasuis ve P. multocida için sırasıyla 157, 120 ve 305 bp amplifiye ürünler beklendi. Amplifiye fragment bir vektöre klonlanarak standart bir plazmit oluşturuldu. Kalıp olarak standart plazmit kullanılarak, A. pleuropneumoniae, H. parasuis ve P. multocida multipl SYBR Green I’in eşzamanlı tespiti için kantitatif bir floresan PCR yöntemi geliştirildi. Erime eğrisi analizi ile birlikte duyarlılık, özgüllük ve tekrarlanabilirlik de değerlendirildi. Sonuçlar, bu yöntemin, bu üç patojeni saptamada duyarlılığının 147, 145 ve 61 bakteri/μL olduğunu gösterdi. Üç spesifik Tm piki veren aynı erime eğrisinde diğer bakterilerle çapraz reaksiyon gözlenmedi ve yöntem iyi bir özgüllük ve tekrarlanabilirlik sergiledi. Bu yöntem, üç patojenin eşzamanlı tespiti için kullanılabilir ve böylelikle hastalıkların önlemesi ve tedavisi için etkili bir teşhis aracı niteliğindedir.

PDF

___

1. Rossi CC, de Araújo EF, de Queiroz MV, Bazzolli DMS: Characterization of the omlA gene from different serotypes of Actinobacillus pleuropneumoniae: A new insight into an old approach. Genet Mol Biol, 36 (2): 243-251, 2013. DOI: 10.1590/s1415-47572013005000012
2. Blackall PJ, Klaasen HLBM, Van Den Bosch H, Kuhnert P, Frey J: Proposal of a new serovar of Actinobacillus pleuropneumoniae: Serovar 15. Vet Microbiol, 84 (1-2): 47-52, 2002. DOI: 10.1016/S0378-1135(01)00428-X
3. Dorey L, Pelligand L, Cheng Z, Lees P: Pharmacokinetic/pharmaco- dynamic integration and modelling of florfenicol for the pig pneumonia pathogens Actinobacillus pleuropneumoniae and Pasteurella multocida. PLoS One, 12 (5): e0177568, 2017. DOI: 10.1371/journal.pone.0177568
4. Zeng Z, Chen X, Yue H, He H, Ren Y, Tang C, Zhang B: The effect of rfaD and rfaF of Haemophilus parasuis on lipooligosaccharide induced inflammation by NF-κB/MAPKs signaling in porcine alveolar macrophages. J Vet Med Sci, 80 (5): 842-845, 2018. DOI: 10.1292/jvms.16-0586
5. Ye C, Li R, Xu L, Qiu Y, Fu S, Liu Y, Wu Z, Hou Y, Hu CAA: Effects of Baicalin on piglet monocytes involving PKC-MAPK signaling pathways induced by Haemophilus parasuis. BMC Vet Res, 15 (1): 98, 2019. DOI: 10.1186/s12917- 019-1840-x
6. Zhang B, Tang C, Liao M, Yue H: Update on the pathogenesis of Haemophilus parasuis infection and virulence factors. Vet Microbiol, 168 (1): 1-7, 2014. DOI: 10.1016/j.vetmic.2013.07.027
7. Guo L, Guo J, Liu HS, Zhang J, Chen X, Qiu Y, Fu S: Tea polyphenols suppress growth and virulence-related factors of Haemophilus parasuis. J Vet Med Sci, 80 (7): 1047-1053, 2018. DOI: 10.1292/jvms.18-0085
8. de Oliveira Filho JX, Mores MAZ, Rebellato R, Kich JD, Cantao ME, Klein CS, Guedes RMC, Coldebella A, de Barcellos DESN, Mores N: Pathogenic variability among Pasteurella multocida type A isolates from Brazilian pig farms. BMC Vet Res, 14 (1): 244, 2018. DOI: 10.1186/s12917-018- 1565-2
9. Bessone FA, Perez MLS, Zielinski G, Dibarbora M, Conde MB, Cappuccio J, Alustiza F: Characterization and comparison of strains of Pasteurella multocida associated with cases of progressive atrophic rhinitis and porcine pneumonia in Argentina. Vet World, 12 (3): 434-439, 2019. DOI: 10.14202/vetworld.2019.434-439
10. Wilson BA, Ho M: Pasteurella multocida: From zoonosis to cellular microbiology. Clin Microbiol Rev, 26 (3): 631-655, 2013. DOI: 10.1128/ CMR.00024-13
11. Dorey L, Hobson S, Lees P: Activity of florfenicol for Actinobacillus pleuropneumoniae and Pasteurella multocida using standardised versus non-standardised methodology. Vet J, 218, 65-70, 2016. DOI: 10.1016/j. tvjl.2016.11.004
12. Opriessnig T, Gimenez-Lirola LG, Halbur PG: Polymicrobial respiratory disease in pigs. Anim Health Res Rev, 12 (2): 133-148, 2011. DOI: 10.1017/ S1466252311000120
13. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT: Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 16 (23): 11141-11156, 1988. DOI: 10.1093/ nar/16.23.11141
14. He Y, Zhao P, Chu YF, Gao PC, Lu ZX: Development of multiplex- PCR for identification of Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis and Actinbacillus pleuropneumoniae. Anim Husb Feed Sci, 2, 25-27, 2010. DOI: 10.19578/j.cnki.ahfs.2010.z2.009
15. Kim TG, Knudsen GR: Comparison of real-time PCR and microscopy to evaluate sclerotial colonisation by a biocontrol fungus. Fungal Biol, 115 (4- 5): 317-325, 2011. DOI: 10.1016/j.funbio.2010.12.008
16. Harper M, Boyce JD: The myriad properties of Pasteurella multocida lipopolysaccharide. Toxins (Basel), 9 (8):254, 2017. DOI: 10.3390/toxins9080254
17. Antenucci F, Fougeroux C, Bosse JT, Magnowska Z, Roesch C, Langford P, Holst PJ, Bojesen AM: Identification and characterization of serovar-independent immunogens in Actinobacillus pleuropneumoniae. Vet Res, 48 (1): 74, 2017. DOI: 10.1186/s13567-017-0479-5
18. Mu SY, Abdullah SW, Zhang Y, Han S, Guo H, Li M, Dong H, Xu J, Teng Z, Wen X, Sun S: Development of a novel SYBR green I-based quantitative RT-PCR assay for Senecavirus A detection in clinical samples of pigs. Mol Cell Probes, 53:101643, 2020. DOI: 10.1016/j.mcp.2020.101643
19. Li Y, Cui Y, Liu H, Wang J, Yongdong L, Wang Y: Establishment of duplex SYBR Green I-based real-time PCR assay for simultaneous detection of duck hepatitis a virus-1 and duck astrovirus-3. Avian Dis, 65 (2): 281-286, 2021. DOI: 10.1637/aviandiseases-D-20-0011
20. Li YD, Yu ZD, Bai CX, Zhang D, Sun P, Peng ML, Liu H, Wang J, Wang Y: Development of a SYBR Green I real-time PCR assay for detection of novel porcine parvovirus 7. Pol J Vet Sci, 24 (1): 43-49, 2021. DOI: 10.24425/ pjvs.2021.136791
21. Hu B, Zhang S, Xu Y, Wang Z, Ren Q, Xu J, Dong Y, Wang L: Development of a SYBR green real-time PCR assay with melting curve analysis for simultaneous detection of Actinobacillus pleuropneumoniae and Haemophilus parasuis. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 26 (5): 665-670, 2020. DOI: 10.9775/kvfd.2020.24110