Floresans ışımaya bağlı minimal inhibisyon konsantrasyon (MİK) belirlenmesi

Disk difüzyon yöntemi ve mikrodilusyon yöntemini kullanan otomatik sistemler son yıllarda mikrobiyoloji laboratuvarlarının vazgeçilmez parçaları olmuşlardır. Ancak, in vitro ölçüm yapan bu sistemler bakterilerin doğal ortamında değil laboratuvar koşullarındaki hassasiyetlerini ölçmektedirler. Bu çalışmanın amacı antibiyotiklerin etkisinin floresans absorbansın ölçüm yöntemiyle belirlenmesini sağlayacak yöntem geliştirmektir. Bu çalışmada içlerinde floresan ışıma yapan protein içeren bakteriler oluşturmak amacıyla rekombinant plazmidler hazırlanmıştır. Floresans kaynak olarak yeşil floresans protein (GFP) pUC18 ve pAT392 plazmidlerine klonlanmıştır. Elde edilen rekombinant plazmidleri içeren bakterilerde konvansiyonel minimal inhibisyon konsantrasyonu (MİK) ölçümü yapılmıştır. Böylece besi yerindeki canlı hücrelerin yaydığı ışığın ölçülmesi esasına dayanarak alternatif bir MİK ölçüm yöntemi geliştirilmeye çalışılmıştır. Her bir antibiyotik grubu için pUC18-gfp ve pAT392-gfp plazmidlerini içeren ve içermeyen E. coli DH10B bakterisi kullanılmıştır. gfp genini içermeyen bakteriler florometrik ölçüm yapabilen cihazda 24 saatlik ölçüm boyunca ışıma vermemiş grafikleri doğrusal bir ivmeyle izlenmiştir. Ancak sadece canlı hücrelerde ışıma yapabilecek olan pUC18-gfp ve pAT392-gfp plazmidini içeren bakteriler antibiyotiğin hiç uygulanmadığı kontrol grubuna göre oldukça yüksek pik yaptıkları gözlenmiştir. İnhibe edici dozlarda grafik doğrusal bir yapı kazanmıştır. Işımanın alındığı konsantrasyonda en az 10 ışık birimi azalmanın okunduğu yere denk gelen antibiyotik dilüsyonu MİK değeri olarak kabul edilmiştir. Konvansiyonel MİK değerleri ile florometrik MİK değerleri karşılaştırılmış en çok 2 dilüsyon fark saptanmıştır. Işımanın ölçülmesiyle MİK düzeyinin belirlenebileceği bu çalışma ile gösterilmiştir. Geliştirilmeye çalışılan bu yöntem antibiyotiklerin bakterisidal/bakteriostatik etkilerinin saptanmasında, antibiyotiklerin biyofilm içindeki bakterilere etkilerinin gözlenmesinde kullanım potansiyeli vardır. Ayrıca yeni antibiyotik geliştirmede kullanılabilecek basit, ucuz ve kolay bir yöntem adayı olarak denenecek moleküllerin daha hızlı ve etkin şekilde değerlendirilmesini sağlayabilme potansiyeli vardır.

Anahtar Kelimeler:

Floresans protein, MİK, Antibiyotik direnci, Klonlama

PDF

___

Allison, D. G., Sattenstall, M. A., 2007. The influence of green fluorescent protein incorporation on bacterial physiology: a note of caution. Journal of applied microbiology. 103(2), 318-324.
Anonim 1: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/advanced-information/. Erişim tarihi Mayıs 2020.
Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C., 1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 263(5148), 802-805.
Clarebout, G., Leclercq, R., 2002. Fluorescence assay for studying the ability of macrolides to induce production of ribosomal methylase. Antimicrobial agents and chemotherapy. 46(7), 2269-2272.
Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 2014. Twenty-first Informational Supplement. CLSI Document M100-S21. CLSI, Wayne, PA.
Collins LA, Torrero MN, Franzblau SG, 1998. Green fluorescent protein reporter microplate assay for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother.42(2):344‐347.
Elf, J., Li, G. W., Xie, X. S., 2007. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science, 316(5828), 1191-1194.
Ellenberg J, Lippincott-Schwartz J, Presley JF, 1998. Two-color green fluorescent protein time-lapse imaging. Biotechniques.25(5):838‐846.
Kalir, S., McClure, J., Pabbaraju, K., Southward, C., Ronen, M., Leibler, S., et al, 2001. Ordering genes in a flagella pathway by analysis of expression kinetics from living bacteria. Science. 292: 2080–2083.
Salih, H., Oryaşın, E., Bozdoğan, B., 2020. pADU94, Kloramfenikol Direncine Sahip Klonlama ve Ekspresyon Vektörü. Turk Mikrobiyol Cemiy Derg. 50 (1):027-034.
Sharma, M., Tyagi, J. L., Poluri, K. M., 2019. Quantifying bacterial cell lysis using GFP based fluorimetric assay. International journal of biological macromolecules. 138, 881-889.
Shimomura, O., Johnson, F.H. and Saiga, Y., 1962. Extraction, Purification and Properties of Aequorin, a Bioluminescent Protein from the Luminous Hydromedusan, Aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology, 59, 223-239.
Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., & Lia, G., 2008. Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells. Annu. Rev. Biophys., 37, 417-444.