Meral KARAMAN, Osman YILMAZ, Vahide BAYRAKAL, İ. Hakkı BAHAR

Gentamisin ve imipenem etkisinde pseudomonas aeruginosa quorum sensing yanıtları ve biyofilm üretimi: In-vivo modelleme

Pseudomonas aeruginosa ciddi solunum yolu infeksiyonlarından sıklıkla soyutlanan fırsatçı bir patojendir. İnfeksiyonların patogenezinde; biyofilm, elastaz, alkalen proteaz, piyosiyanin, fosfolipaz ve ekzotoksin A gibi çeşitli virülans faktörlerinin üretimini düzenleyen, quorum sensing (çoğunluğu algılama) olarak adlandırılan hücreden hücreye iletişim sistemi sorumlu tutulmaktadır. P.aeruginosa AHL (acylhomoserine lactone) temelli ve birbiri ile ilişkili üç quorum sensing sistemine sahiptir; las, rhl ve kinolon. Bu sistem ile bakteri, bulunduğu ortamda kendi populasyon yoğunluğunu algılayabilmekte ve sinyal molekülleri eşik değere ulaştığında belirli virülans faktörlerinin üretimini düzenleyebilmektedir. Bakterinin in-vitro ve in-vivo davranışlarının karşılaştırılması, bakteri, konak ve antibakteriyeller arasındaki etkileşimin açıklanmasında hayvan modelleri sıklıkla kullanılmaktadır. Çalışmamızda, fenotipik ve genotipik özellikleri bilinen P.aeruginosa PAO1 (Wild type) ve PAO JP2 (?lasI/?rhlI) referans laboratuvar suşları ile sıçanlarda kronik akciğer infeksiyonu modeli oluşturulmuştur. Bu model için suşların emdirildiği agar boncuklar sıçanlara intra-trakeal yol ile uygulanmıştır. On dört günlük infeksiyon sürecinin sonunda sıçanların BAL ve akciğer dokularından soyutlanan suşların gentamisin ve imipenem için MİK değerleri, bu antibiyotiklerin etkisinde quorum sensing yanıtları ve biyofilm üretimlerindeki değişiklikler araştırılmıştır. Quorum sensing yanıtları “mikro AHL”, biyofilm üretimleri “kristal viyole boyama” yöntemi ile belirlenmiştir. Konakçı ile karşılaşma sonrası bu referans laboratuvar suşlarının MİK aralıklarının ve quorum sensing aktivitelerinin değiştiği, genel olarak gentamisin ve imipenemin MİK düzeylerinde biyofilm üretimi gözlenmezken, sub-MİK yoğunluklarında biyofilm üretiminin olduğu belirlenmiştir. Sonuçlarımız, P.aeruginosa suşlarında in-vivo şartlarda, gentamisin ve imipenemin düşük yoğunluklarında biyofilm üretiminin indüklendiğini göstermektedir. Bu çalışma ile P.aeruginosa’ya ait virülans faktörlerinin ve quorum sensing sistemlerinin anlaşılmasında hayvan modellerinin önemi bir kez daha ortaya konmuştur.

Pseudomonas aeruginosa quorum sensing responses and biofilm production under the influence of gentamicin and imipenem: In vivo modelling

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen isolated frequently from serious upper respiratory tract infections. In the pathogenesis of these infections, cell to cell communication system of the bacteria, known as quorum sensing system, is held responsible for regulating production of various virulence factors such as biofilm, elastase, alkaline protease, pyocyanin, phospholipase and exotoxin A. P.aeruginosa possesses AHL (acylhomoserine lactone) mediated and interrelated three quorum sensing sytems; las, rhl and quinolone. P.aeruginosa perceives local density of their population by quorum sensing system and as the concentration of the signalling molecules passes a threshold, bacteria regulate production of certain virulence factors. Experimental animal models are widely used in comparison of in vitro and in vivo behaviours of the bacteria, in displaying interactions between bacteria, host and antimicrobials. In our study, we developed a chronic pulmonary infection model in rats using P.aeruginosa PAO1 (Wild type) and PAO JP2 (?lasI/?rhlI) reference laboratory strains whose phenotypic and genotypic properties are well known. Intratracheal inoculation of rats with bacterial strains embedded in agarose beads was used as the experimental model. Following fourteen days of infectious period, we investigated gentamicin and imipenem MIC values of the strains that were isolated from BAL and pulmonary tissue samples of rats, also quorum sensing responses and changes in the biofilm production of the strains under the influence of these antibiotics, as well. Quorum sensing responses were determined by “micro AHL“ method, biofilm formation by “crystal violet staining” method. We determined that, MIC intervals and quorum sensing activities have changed when the laboratory strains encountered a host, and in general, biofilm formation has been detected at sub-MIC values but not at MIC values of gentamicin and imipenem. Our results indicate that in vivo biofilm formation in P. Aeruginosa strains can be induced at low gentamicin and imipenem concen-trations. With this study, the importance of animal modelling in the experimental studies conducted to understand P.aeruginosa virulence factors and quorum sensing systems is revealed once more.

PDF

___

1. Bagge N, Schuster M, Hentzer M et al: Pseudomonas aeruginosa biofilms exposed to imipenem exhibit changes in global gene expression and beta-lactamase and alginate production, Antimicrob Agents Chemother 2004;48(4):1175-87.
2. Baskın H, Doğan Y, Bahar İH, Yuluğ N: Effect of subminimal inhibitory concentrations of three fluroquinolones on adherence of uropathogenic strains of Escherichia coli, Int J Antimicrob Agents 2002;19(1):79-82.
3. Bjarnsholt T, Givskov M: Quorum sensing inhibitory drugs as next generation antimicrobials: worth the effort? Curr Infect Dis Rep 2008;10(1):22-8.
4. Cash HA, Woods DE, McCullough B, Johanson WG Jr, Bass JA: A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa, Am Rev Respir Dis 1979;119(3):453-9.
5. Clinical Laboratory Standards Institute: Antimikrobik Duyarlılık Testleri için Uygulama Standartları; Onaylanmış standart-Onaltıncı baskı, M100-S16, CLSI, Wayne, PA (2006).
6. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP: Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections, Science 1999;284(5418):1318-22.
7. Davies DG, Parsek MR, Pearson JP, Iglewski BH, Costerton JW, Grrenberg EP: The involvement of the cell-to- cell signals in the development of a biofilm, Science 1998;280(5361):295-8.
8. Dekimpe V, Déziel E: Revisiting the quorumsensing hierarchy in Pseudomonas aeruginosa: the transcriptional regulator RhlR regulates LasRspecific factors, Microbiology 2009;155(Pt 3):712-23.
9. Diggle SP, Winzer K, Chhabra SR, Worrall KE, Camara M, Williams P: Pseudomonas aeruginosa quinolone signal molecule overcomes the cell density-dependency of the quorum sensing hierarchy, regulates rhl-dependent genes at the onset of stationary phase and can be produced in the absence of LasR, Mol Microbiol 2003;50(1):29-43.
10. Donlan RM, Costerton JW: Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms, Clin Microbiol Rev 2002;15(2):167-93.
11. Favre-Bonté S, Chamot E, Köhler T, Romand JA, van Delden C: Autoinducer production and quorum-sensing dependent phenotypes of Pseudomonas aeruginosa vary according to isolation site during colonization of intubated patients, BMC Microbiol 2007;7:33, Doi.10.1186/1471-2180-7-33.
12. Grossi P, Dalla Gasperina D: Treatment of Pseudomonas aeruginosa infection in critically ill patients, Expert Rev Anti Infect Ther 2006;4(4):639-62.
13. Hoffman LR, D’Argenio DA, MacCoss MJ, Zhang Z, Jones RA, Miller SI: Aminoglycoside antibiotics induce bacterial biofilm formation, Nature 2005;436(7054):1171-5.
14. Høiby N, Bjarnsholt T, Givskov M, Molin S, Ciofu O: Antibiotic resistance of bacterial biofilms, Int J Antimicrob Agents 2010;35(4):322-32.
15. Kanamaru S, Kurazono H, Terai A et al: Increased biofilm formation in Escherichia coli isolated from acute prostatitis, Int J Antimicrob Agents 2006;28(Suppl 1):21-5.
16. Köhler T, Dumas JL, Van Delden C: Ribosome protection prevents azithromycin-mediated quorum-sensing modulation and stationary-phase killing of Pseudomonas aeruginosa, Antimicrob Agents Chemother 2007;51(12):4243-8.
17. Lesprit P, Faurisson F, Join-Lambert O et al: Role of the quorum-sensing system in experimental pneumonia due to Pseudomonas aeruginosa in rats, Am J Respir Crit Care Med 2003;167(11):1478-82.
18. Matsukawa M, Greenberg EP: Putative exopolysaccharide synthesis genes influence Pseudomonas aeruginosa biofilm development, J Bacteriol 2004;186(14):4449-56.
19. Nick JA, Rodman DM: Manifestations of cystic fibrosis diagnosed in adulthood, Curr Opin Pulm Med 2005;11(6):513-8.
20. Rashid MH, Rumbaugh K, Passador L et al: Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa, Proc Natl Acad Sci USA, 2000;97(17):9636-41.
21. Rumbaugh KP, Griswold JA, Hamood AN: The role of quorum sensing in the in vivo virulence of Pseudomonas aeruginosa, Microbes Infect 2000;2(14):1721-31.
22. Stotland PK, Radzioch D, Stevenson MM: Mouse models of chronic lung infection with Pseudomonas aeruginosa: Models for the study of cystic fibrosis, Pediatric Pulmonol 2000;30(5):413-24.
23. Vivas J, Razquin BE, Lopez-Fierro P, Naharro G, Villena A: Correlation between production of acyl homoserine lactones and proteases in an Aeromonas hydrophila aroA live vaccine, Vet Microbiol 2004;101(3):167-76.
24. Waters CM, Bassler BL: Quorum sensing: cell-tocell communication in bacteria, Annu Rev Cell Dev Biol 2005;21:319-46.
25. Williams P, Winzer K, Chan WC, Cámara M: Look who’s talking: communication and quorum sensing in the bacterial world, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2007;362(1483):1119-34.