Isıl İşlem Görmüş Sütlerde Salmonella Typhimurium Canlı Hücrelerinin PMA/Real-Time PCR ile Belirlenmesi

Gıdaların üretimi sırasında uygulanan farklı teknolojik işlemler bakteriler üzerinde öldürücü etki göstermesine rağmen, bu bakterilere ait DNA'lar belirli bir süre varlıklarını korudukları için real- time PCR tekniği ile tespit edildiklerinde yanlış pozitif sonuçlara neden olabilmektedirler. Real- time PCR tekniğinin bu eksikliğini gidermek amacıyla son yıllarda DNA ekstraksiyonu öncesinde, ölü hücrelere ait DNA'ların Propodium Monoazide (PMA) ile muamele edilerek ortamdan uzaklaştırılmasına dayanan yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu çalışmada ise, ısıl işlem uygulanmış süt örneklerinde, S. Typhimurium'un canlı hücrelerinin tespiti için real-time PCR yöntemi, PMA uygulaması ile kombine edilmiştir. Bu amaçla S. Typhimurium ile inokule edilen süt örneklerine farklı sıcaklık (60, 65, 70 ve 75ºC) ve sürelerde (15, 60, 300 ve 900 sn) ısıl işlem uygulanmış ve canlı bakteri sayısı, direkt real-time PCR, PMA/real-time PCR ve klasik kültüre alma yöntemleriyle karşılaştırmalı olarak belirlenmiştir. Sonuçta test edilen tüm sıcaklık derece ve sürelerinde PMA/real- time PCR yönteminin direkt real-time PCR tekniğinin aksine ölü hücrelerden kaynaklanan yanlış pozitif sonuçları belli bir dereceye kadar önlediği ancak kültürel sayım sonuçlarına kıyasla daha yüksek sonuçlar verdiği belirlenmiştir. Dolaysıyla PMA/real-time PCR yöntemi ile elde edilen yüksek pozitif sonuçları elemine etmek için, PMA uygulamasına ait koşulların optimizasyonuna yönelik daha ileri çalışmalara ihtiyaç olduğu sonucuna varılmıştır.

Determination of Viable Salmonella Typhimurium Cells in Heat Treated Milk By PMA/Real-Time PCR Method

Gıdaların üretimi sırasında uygulanan farklı teknolojik işlemler bakteriler üzerinde öldürücü etki göstermesine rağmen, bu bakterilere ait DNA’lar belirli bir süre varlıklarını korudukları için real- time PCR tekniği ile tespit edildiklerinde yanlış pozitif sonuçlara neden olabilmektedirler. Real- time PCR tekniğinin bu eksikliğini gidermek amacıyla son yıllarda DNA ekstraksiyonu öncesinde, ölü hücrelere ait DNA’ların Propodium Monoazide (PMA) ile muamele edilerek ortamdan uzaklaştırılmasına dayanan yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu çalışmada ise, ısıl işlem uygulanmış süt örneklerinde, S. Typhimurium’un canlı hücrelerinin tespiti için real-time PCR yöntemi, PMA uygulaması ile kombine edilmiştir. Bu amaçla S. Typhimurium ile inokule edilen süt örneklerine farklı sıcaklık (60, 65, 70 ve 75ºC) ve sürelerde (15, 60, 300 ve 900 sn) ısıl işlem uygulanmış ve canlı bakteri sayısı, direkt real-time PCR, PMA/real-time PCR ve klasik kültüre alma yöntemleriyle karşılaştırmalı olarak belirlenmiştir. Sonuçta test edilen tüm sıcaklık derece ve sürelerinde PMA/real- time PCR yönteminin direkt real-time PCR tekniğinin aksine ölü hücrelerden kaynaklanan yanlış pozitif sonuçları belli bir dereceye kadar önlediği ancak kültürel sayım sonuçlarına kıyasla daha yüksek sonuçlar verdiği belirlenmiştir. Dolaysıyla PMA/real-time PCR yöntemi ile elde edilen yüksek pozitif sonuçları elemine etmek için, PMA uygulamasına ait koşulların optimizasyonuna yönelik daha ileri çalışmalara ihtiyaç olduğu sonucuna varılmıştır.

PDF

___

Andrews-Polymenis HL, Baumler AJ, McCormick BA, Fang FC. 2010. Taming the elephant: Salmonella biology, pathogenesis, and prevention. Infect and Immun, 78: 2356- 2369.
Anonim. 2004. EN ISO 6579:20024, 2004. Microbiology of food and animal feeding stuffs — horizontal method for the detection of Salmonella (EN ISO 6579:20024). International Organization for Standardization, Geneva, Switzerland.
Byrne B, Stack E, Gilmartin N, O’Kennedy R. 2009. Antibody- Based Sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors, 9: 4407–4445.
Cawthorn DM, Witthuhn RC. 2008. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide. J Appl Microbiol, 105: 1178–1185.
Dwivedi HP, Jaykus L. 2011. Detection of pathogens in foods: the current state-of-the-art and future directions. Crit Rev Microbiol, 37: 40–63.
Elizaquìvel P, Sanchez G, Aznar R. 2012. Quantitative detection of monocytogenes and Salmonella in fresh-cut vegetables combining propidium monoazide and real-time PCR. Food Control 25: 704–708. E. coli O157:H7, Listeria
Hein I, Flekna G, Krassnig M, Wagner M. 2006. Real-time PCR for the detection of Salmonella spp. in food: An alternative approach to a conventional pcr system suggested by the FOOD-PCR Project. J Microbiol Methods, 66: 538-547.
Jiang Q, Fu B, Chen Y, Wang Y, Liu H. 2013. Quantification of viable but nonculturable bacterial pathogens in anaerobic digested sludge. Appl Microbiol Biotechnol, 97: 6043-6050.
Josefsen MH, Lofstrom C, Hansen TB, Christensen LS, Olsen JE. Hoorfar J. 2010. Rapid quantification of viable Campylobacter bacteria on chicken carcasses, using real- time PCR and propidium monoazide treatment, as a tool for quantitative risk assessment. Appl Environ Microbiol, 76: 5097–5104.
Lee JL, Levin RE. 2009. A comparative study of the ability of EMA and PMA to distinguish viable from heat killed mixed bacterial flora from fish fillets. J Microbiol Methods, 76: 93 96.
Lee KM, Runyon M, Herrman TJ, Phillips R, Hsieh J. 2015. Review of Salmonella detection and identification methods: Aspects of rapid emergency response and food safety. Food Control, 47:264-276.
Li F, Li F, Chen B, Zhou B, Yu P, Yu S, Lai W, Xu H. 2016. Sextuplex PCR combined with immunomagnetic separation and PMA treatment for rapid detection and specific identification of viable Salmonella spp., Salmonella enterica serovars Paratyphi B, Salmonella Typhimurium, and Salmonella Enteritidis in raw meat. Food Control, 1-8.
Liang N, Dong J, Luo L, Li Y. 2011. Detection of viable Salmonella in lettuce by propidium monoazide real-time PCR. J Food Sci, 76: 234-237.
Liu Y, Mustapha A. 2014. Detection of viable Escherichia coli O157:H7 in ground beef by propidium monoazide real-time PCR. Int J Food Sci, 170: 48-54.
Lİvdal T, Hovda MB, Björblom B, Mİller SG. 2011. Propidium monoazide combined with real-time quantitative PCR underestimates heat-killed Listeria innocua. J Microbiol Methods, 85: 164-169.
Majowicz SE, Musto J, Scallan E, Angulo FJ, Kirk M, O’Brien SJ, Jones TF, Fazil A, Hoekstra RM. 2010. The global burden of nontyphodial Salmonella gastroenteritis. Clin Infect Dis, 50: 882-889.
Malorny B, Mäde D, Löfström C. 2013. Real-time PCR Detection of Food-Borne Pathogenic Salmonella spp. “InReal-time PCR in Food Science Current Technology and Applications”. (Ed) D. Rodrìguez-Làzaro, Caister Academic Press. Spain, 57-77.
McCABE EM, Burgess CM, Walsh D, O'Regan E, McGuinness S, Barry T, Fanning S, Duffy G. 2011. Validation of DNA and RNA real-time assays for food analysis using the hilA gene of Salmonella enterica serovars. J Microbiol Methods, 84: 19 –26.
McGuinness S, McCabe E, O’Regan E, Dolan A, Duffy G, Burgess C, Fanning S, Barry, T, O’Grady J. 2009. Development and validation of a rapid real-time pcr based method for the speciŞc detection of Salmonella on fresh meat. Meat Sci, 83: 555-5562.
Nam HM, Srinivasan V, Gillespie BE, Murinda SE, Oliver SP. 2005. Application of SYBR Green real-time PCR assay for specific detection of Salmonella spp. in dairy farm environmental samples. Int J Food Microbiol, 102: 161 171.
Nocker A, Cheung CY, Camper AK. 2006. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J Microbiol Methods, 67: 310– 320.
Nocker A, Camper AK. 2006. Selective removal of DNA from dead cells of mixed bacterial communities by use of ethidium monoazide. Appl Environ Microbiol, 72: 1997- 2004.
Nocker A, Mazza A, Masson L, Camper AK, Brousseau R. 2009. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. J Microbiol Methods, 76: 253–261.
Nogva HK, Drİmtorp SM, Nissen H, Rudi K. 2003. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-Nuclease PCR. Biotechniques, 34: 804– 813.
Pan Y, Breidt F Jr. 2007. Enumeration of viable Listeria monocytogenes cells by real-time PCR with propidium monoazide and ethidium monoazide in the presence of dead cells. Appl Environ Microbiol, 73: 8028–8031.
Velusamy V, Arshak K, Korostynska O, Oliwa K, Adley C. 2010. An overview of food-borne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol Adv, 28: 232–254.
Wagner AO, Malin C, Knapp BA, Illmer P. 2008. Removal of free extracellular DNA from environmental samples by ethidium monoazide and propidium monoazide. Appl Environ Microbiol, 74: 2537-2539.
Wang J, Li R, Hu L, Sun X, Wang J, Li J. 2016. Development of a quantitative fluorescence single primer isothermal amplification-based method for the detection of Salmonella. Int J Food Microbiol, 219: 22-27.