Ali ÜÇKAYABAŞI, Tülay KANDEMİR, Toğrul NAĞIYEV

Keratit olgularında mikrobiyal etkenlerle birlikte mikobakteri varlığının araştırılması

Amaç: Tüberküloz dışı mikobakterilerin (TDM) ayırıcı tanısındaki çeşitli sorunlar sebebiyle klinisyenler bu fırsatçı bakterileri göz ardı edebilmektedirler. Pulmoner tüberküloz şüpheli hastalarda mikobakteri identifikasyonu ve ilaç direnç tayininde olduğu gibi mikobakteriyel keratit gibi akciğer dışı mikobakteri enfeksiyonlarının tanısında da son yıllarda başarıyla uygulanan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) temelli moleküler yöntemlerde DNA genellikle bakteri kültüründen ekstrakte edilmektedir. Kültürde özellikle mikobakterilerde yaşanan zorluklar göz önüne alındığında, yalnızca kültürden değil, doğrudan klinik örneklerden de DNA ekstraksiyonunun hızlı ve doğru tanı protokollerinin geliştirilmesine ışık tutacağı düşünülmektedir. Bu çalışmada keratitli hastaların korneal kazıntı örneklerinde mikrobiyal etkenlerle birlikte mikobakteri varlığının araştırılması amaçlanmıştır. Yöntem: Keratit tanısı alan 43 hastadan bakteriyolojik ve mikolojik incelemeler için korneal kazıntı örnekleri alınmıştır. Rutin bakteri ve mantar kültürlerine ek olarak yapılan mikobakteriyolojik incelemede örnekler Löwenstein-Jensen (LJ) ve Mycobacterium growth indicator tube (MGIT) 960 likit sistemde inoküle edilmiş ve direkt preparasyonlar Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) yöntemi ile boyanarak mikroskobik olarak incelenmiştir. Mikobakteri varlığı aynı zamanda doğrudan korneal kazıntı örneklerinden DNA ekstraksiyonu sonrasında hsp65 gen bölgesini hedef alan spesifik primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) testi ile de araştırılmıştır. Bulgular: Gerek fenotipik gerekse moleküler yöntemlerle yapılan mikobakteriyolojik inceleme sonucunda korneal kazıntı örneklerinin hiçbirinde mikobakteri kolonizasyonu tespit edilememiştir. Değerlendirilen 43 keratitli hastanın %39,5’inden mikobakteri dışında çeşitli bakteriler izole edildiği, kadınlarda bu oranın %47,1, erkeklerde ise %34,66 olduğu tespit edilmiştir. En sık izole edilen bakteriyel etkenin Staphylococcus epidermidis (%23,3) olduğu, miks kolonizasyon oranının da %16,3 olduğu belirlenmiştir. Bakteriyolojik ve patolojik inceleme sonuçları ile tanı grupları, cinsiyet ve yaş arasında bir ilişki bulunmasa da, keratite eşlik eden ek göz hastalığının daha ileri yaşlarda görülmesi istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p=0.036). Sonuç: Çalışmamızda hiç mikobakteri tespit edilemese de, doğrudan korneal kazıntı örneklerinde moleküler bir yöntemle mikobakterilerin araştırıldığı ilk çalışma özelliğini taşımaktadır. Sonuç olarak, daha geniş populasyonda yapılacak çalışmalarda, gözden kaçan mikobakteri olgularının erken ve doğru teşhisinin hızlı ilaç direnci tespiti ile tedavi stratejilerinin daha akılcı bir şekilde planlanmasına imkan sağlayacağı kanaatine varılmıştır. Özellikle de, keratit olgularının neredeyse tamamının (%95) çoklu ilaç dirençli tüberküloz (MDR TB) ve TDM enfeksiyonları için en önemli tedavi seçenekleri olan florokinolon ve/veya amikasin ile tedavi edilmesi, mikobakterilerin kolonizasyonunun ve bulaştırıcılığının geçici olarak baskılanmış olabileceğini, ancak yakın gelecekte bu ilaçlara dirençli mikobakterilerin sebep olduğu enfeksiyonlara maruz kalabileceğimizi düşündürmektedir.

Investigation of the presence of mycobacteria along with microbial agents in cases of keratitis

Objective: Because of various problems in the differential diagnosis of non-tuberculous mycobacteria (NTM), clinicians may ignore these opportunistic bacteria. DNA is usually extracted from the bacterial culture in polymerase chain reaction (PCR)-based molecular methods, which have been successfully applied in recent years in the diagnosis of extrapulmonary mycobacterial infections such as mycobacterial keratitis, as well as in mycobacterial identification and drug resistance determination in patients with suspected pulmonary tuberculosis. Considering the difficulties experienced in culture, especially in mycobacteria, it is thought that DNA extraction not only from culture but also directly from clinical samples will shed light on the development of rapid and accurate diagnostic protocols. In this study, it was aimed to investigate the presence of mycobacteria along with microbial agents in corneal scraping samples of patients with keratitis. Methods: Corneal scraping samples were collected for bacteriological and mycological examinations from 43 patients diagnosed with keratitis at Balcalı Hospital of Çukurova University Faculty of Medicine between September 2016 and April 2017. In addition to routine bacterial and fungal cultures, in mycobacteriological examination, samples were inoculated in Löwenstein-Jensen (LJ) and Mycobacterium growth indicator tube (MGIT) 960 liquid system, and direct preparations were stained with the Ehrlich-Ziehl-Neelsen (EZN) method and examined microscopically. The existence of mycobacteria was also investigated by polymerase chain reaction (PCR) testing using specific primers targeting the hsp65 gene region after DNA extraction directly from corneal scraping samples. Results: No mycobacterial colonization could be detected in any of the corneal scraping samples as a result of mycobacteriological examination performed by both phenotypic and molecular methods. It was determined that various bacteria, except mycobacteria, were isolated from 39.5% of the 43 patients with keratitis evaluated, this rate was 47.1% in women and 34.66% in men. It was determined that the most frequently isolated bacterial agent was Staphylococcus epidermidis (23.3%), and the mixed colonization rate was 16.3%. Although there was no relationship between the results of bacteriological and pathological examinations and the diagnosis groups, gender, and age, it was statistically significant that additional eye disease accompanying keratitis was seen at older ages (p=0.036). Conclusion: Although no mycobacteria were detected in our study, it is the first study in which mycobacteria were investigated by a molecular method in direct corneal scraping samples. It was concluded that early and accurate diagnosis of overlooked mycobacterial cases would enable rapid drug resistance detection and treatment strategies to be planned more rationally, in the light of studies to be conducted with larger populations. In particular, the treatment of almost all keratitis cases (95%) with fluoroquinolones and/or amikacin, which are the most important therapeutic options for multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) and TDM infections, suggests that mycobacterial colonization and infectivity may be temporarily suppressed. However, this may result in our exposure to infections caused by mycobacteria resistant to these drugs in the near future.

PDF

___

1. Hazırolan G, Kemer ÖE, Özek D, Aksoy A, Aksu N. Vorikonazol ile tedavi edilen bir Aspergillus flavus kompleks keratit olgusu. Turk Hij Den Biyol Derg, 2016; 73(4): 389-94. doi: 10.5505/TurkHijyen.2016.81905.
2. Szczotka-Flynn LB, Shovlin JP, Schnider CM, Caffery BE, Alfonso EC, Carnt NA, et al. American academy of optometry microbial keratitis think tank. Optom Vis Sci, 2021; 98(3): 182–98. doi: 10.1097/OPX.0000000000001664.
3. Kheir WJ, Sheheitli H, Fattah MA, Hamam RO. Nontuberculous mycobacterial ocular infections: a systematic review of the literature. Biomed Res Int, 2015; 164989. doi: 10.1155/2015/164989.
4. Chu HS, Chang SC, Shen EP, Hu FR. Nontuberculous mycobacterial ocular infections comparing the clinical and microbiological characteristics between Mycobacterium abscessus and Mycobacterium massiliense. Plos One, 2015; 10(1): e0116236. doi: 10.1371/journal.pone.0116236.
5. Honarvara B, Movahedan H, Mahmoodi M, Sheikholeslamic FM, Farnia P. Mycobacterium aurum keratitis: an unusual etiology of a sight-threatening infection. Braz J Infect Dis, 2012; 16(2): 204-8. doi: 10.1590/S1413-86702012000200019.
6. Sarah B, Batoul MS, Ibtissam H, Ouafa H, Said A, Abdeljalil M. Corneal manifestations of tuberculosis: about 2 cases. Am J Med Case Rep, 2016; 4(5): 160-4. doi: 10.12691/ajmcr-4-5-4.
7. Gusmao FA, Alveranga L, Barbosa L, Sampaio J, Leao SC, Hofling AL, et al. Deep stromal mycobacterial keratitis: viable bacteria after six months of treatment: case report and literature review. Arq Bras Oftalmol, 2005; 68(4): 551-3. doi: 10.1590/s0004-27492005000400024.
8. Ceyhan İ, Tarhan G, Cesur S, Gümüslü F. Mycobacterium chelonae keratitis following lasik in situ keratomileusis (LASIK) specifically identified by INNO-LIPA method. Turk J Med Sci, 2005; 35: 273-7.
9. Ko J, Kim SK, Yong DE, Kim T, Kim EK. Delayed onset Mycobacterium intracellulare keratitis after laser in situ keratomileusis. Medicine, 2017; 96(51): e9356. doi: 10.1097/MD.0000000000009356.
10. Silva SC, Almeida IN, Ribeiro WC, Miranda SS, Rocha ACH. Mycobacterium abscessus subsp. bolletii keratitis: rare case reported in Brazil. Rev Inst Med Trop São Paulo, 2020; 62: e6. doi: 10.1590/S1678-9946202062006.
11. Bostan C, Slim E, Choremis J, Boutin T, Brunette I, Mabon M, et al. Successful management of severe post-LASIK Mycobacterium abscessus keratitis with topical amikacin and linezolid, flap ablation, and topical corticosteroids. J Cataract Refract Surg, 2019; 45: 1032–5. doi: 10.1016/j.jcrs.2019.03.001.
12. Egrilmez S, Yildirim-Theveny Ş. Treatment-resistant bacterial keratitis: challenges and solutions. Clin Ophthalmol, 2020; 14: 287–97. doi: 10.2147/OPTH.S181997.
13. Frueh BE, Dubuis O, Imesch P, Bohnke M, Bodmer T. Mycobacterium szulgai keratitis. Arch Ophthalmol, 2000; 118(8): 1123-4. doi:10.1001/archopht.118.8.1123.
14. Leal Jr SM, Rodino KG, Fowler WC, Gilligan PH. Practical guidance for clinical microbiology laboratories: diagnosis of ocular infections. Clin Microbiol Rev, 2021; 34(3): e0007019. doi: 10.1128/CMR.00070-19.
15. Zhao G, Zhai H, Yuan Q, Sun S, Liu T, Xie L. Rapid and sensitive diagnosis of fungal keratitis with direct PCR without template DNA extraction. Clin Microbiol Infect, 2014; 20(10): 776-82. doi: 10.1111/1469-0691.12571.
16. Kim E, Chidambaram JD, Srinivasan M, Lalitha P, Wee D, Lietman TM, et al. Prospective comparison of microbial culture and polymerase chain reaction in the diagnosis of corneal ulcer. Am J Ophthalmol, 2008; 146(5): 714-23. doi: 10.1016/j.ajo.2008.06.009.
17. Tuft S, Somerville TF, Li JPO, Neal T, De S, Horsburgh MJ, et al. Bacterial keratitis: identifying the areas of clinical uncertainty. Prog Retin Eye Res, 2021; 101031. doi: 10.1016/j.preteyeres.2021.101031.
18. Hoffman JJ, Dart JKG, De SK, Carnt N, Cleary G, Hau S. Comparison of culture, confocal microscopy and PCR in routine hospital use for microbial keratitis diagnosis. Eye, 2021. doi.org/10.1038/s41433-021-01812-7.
19. Abu Eleinen KG, Mohalhal AA, Elmekawy HE, Abdulbaki AM, Sherif AM, El-Sherif RH, et al. Polymerase chain reaction-guided diagnosis of infective keratitis – a hospital based study. Curr Eye Res, 2012; 37(11): 1005-11. doi: 10.3109/02713683.2012.698357.
20. Oda Y, Sadakane K, Yoshikawa Y, Imanaka T, Takiguchi K, Hayashi M, et al. Highly concentrated ethanol solutions: good solvents for DNA as revealed by single-molecule observation. ChemPhysChem, 2016; 17: 471-3. doi: 10.1002/cphc.201500988.
21. Morlock GP, Crawford JT, Butler WR, Brim SE, Sikes D, Mazurek GH, et al. Phenotypic characterization of pnca mutants of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2000; 44(9): 2291-5. doi: 10.1128/AAC.44.9.2291-2295.2000.
22. Saifi M, Jabbarzadeh E, Bahrmand AR, Karimi A, Pourazar S, Fateh A, et al. HSP65-PRA identification of non-tuberculosis mycobacteria from 4892 samples suspicious for mycobacterial infections. Clin Microbiol Infect, 2013; 19(8): 723-8. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.04005.x.
23. Lange C, Abubakar I, Alffenaar JWC, Bothamley G, Caminero JA, Carvalho ACC, et al. Management of patients with multidrugresistant/extensively drug-resistant tuberculosis in Europe: a TBNET consensus statement. Eur Respir J, 2014; 44(1): 23–63. doi: 10.1183/09031936.00188313.
24. Ong HS, Sharma N, Phee LM, Mehta JS. Atypical microbial keratitis. The Ocular Surface, 2021; doi: 10.1016/j.jtos.2021.11.001.
25. Nascimento H, Viana-Niero C, Nogueira CL, Martins Bispo PJ, Pinto F, de Paula Pereira Uzam C, et al. Identification of the infection source of an outbreak of Mycobacterium chelonae keratitis after laser in situ keratomileusis. Cornea, 2018; 37(1): 116-22. doi: 10.1097/ico.0000000000001423.
26. Güler M, Kurt J, Evren Ö, Çeliker Ü. Yöremizdeki bakteriyel keratitlerin klinik ve mikrobiyolojik özellikleri. Fırat Tıp Dergisi, 2008; 13(4): 235-8.
27. Akova-Budak B, Baykara M, Türüdü S, Yusupov M, Çevik G, Özmen AT, et al. Kliniğimize yatırılarak tedavi edilen keratit olgularının analizi. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 2011; 37(3): 155-7.
28. Yılmaz S, Öztürk I, Türe M, Maden A. Mikrobiyal keratit tedavisinde 16 yıl. T Klinikleri J Ophthalmol, 2008; 17(1): 1-6.
29. Manga G, Çağlar N, Mutluergil N. Fliktenli keratokonjonktivit. Atatürk Üniversitesi Tıp Bülteni, 1990; 22(2): 439-42.
30. Abshire R, Cockrum P, Crider J, Schlech B. Topical antibacterial therapy for mycobacterial keratitis: potential for surgical prophylaxis and treatment. Clin Ther, 2004; 26(2): 191-6. doi: 10.1016/s0149-2918(04)90018-5.
31. Sampaio JLM, Junior DN, Freitas D, Höfling-Lima AL, Miyashiro K, Alberto FL, Leao SC. An outbreak of keratitis caused by Mycobacterium immunogenum. J Clih Microbiol, 2006; 44(9): 3201-7. doi: 10.1128/JCM.00656-06.