Mithat EVECEN, Kemal AK, Sema BİRLER, Serhat PABUÇÇUOĞLU, İ. Kamuran İLERİ, Serhat ALKAN

Koyun embriyolarının in vitro üretilmesi üzerine olgunlaşma ve fertilizasyon medyumlarına yapılan katkılar ve koyun ovidukt epitel hücreleri ile ko-kültürün etkileri

Koyun embriyolarının in vitro üretilmesi üzerine olgunlaşma ve fertilizasyon medyumlarına yapılan katkılar ve ko-kültürün etkilerinin incelendiği bu çalışmada mezbahada kesilen koyunların ovaryumlanndan elde edilen primer oositler (n=454) kullanıldı. Oositler 4 gruba ayrılarak farklı katkıların bulunduğu TCM-199 medyumunda 26 saat olgunlaştınldı: Grup 1 (SH): %20 oranında koyun serumu, 10 $mu$g/ml FSH, 10 $mu$g/ml LH ve 1 $mu$g/ml estradiol 17ß ilaveli TCM-199, Grup 2 (S): %20 oranında koyun serumu ilaveli TCM-199, Grup 3 (H): 10 $mu$g/ml FSH, 10 $mu$g/ml LH ve 1 $mu$g/ml estradiol 17ß ilaveli TCM-199, ve Grup 4 (M): hormon ve serum ilavesi olmayan TCM-199. Olgunlaşmayı takiben oositler tekrar 3'er alt gruba ayrılarak %2 (D), %5 (O)ve %10 (Y) koyun östrus serumu ilaveli SOF medyumu içerisine alındı ve üzerlerine elektro-ejakülatör yardımıyla alınmış ve yıkanmış taze koç sperması ilave edilerek 18 saat in vitro fertilize edildi. Fertilizasyonu takiben oositler kendi içlerinde tekrar 2'şer alt gruba [Grup 1 (KK): Koyun ovidukt epitel hücreleri ile ko-kültür; Grup 2 (K): Koyun ovidukt epitel hücreleri kullanılmayan kültür grubu] ayrıldı ve 7 gün kültüre edildi. Bu sürenin sonunda embriyoların gelişmeleri değerlendirildi. Çalışmada en yüksek cleavage (yanklanma) ve morula oranlan SH+Y+KK grubunda (sırasıyla %62.5 ve %43.8), en düşük oranlar ise (sırasıyla %8.7 ve %4.3) M+D+K grubunda elde edildi. Bu sonuçlara göre, koyun oositlerinin in vitro olgunlaştırılmasında %20 oranında koyun serumu ve hormonların, fertilizasyon medyumunda %10 oranında östrustaki koyun serumunun kullanılması ve fertilizasyon sonrası koyun ovidukt epitel hücreleri ile ko-kültür uygulanmasının yarıklanma ve morula oranlarını iyileştirdiği söylenebilir.

Effects of supplements to maturation and fertilization media and co-culture with sheep oviductal epithelial cells on in vitro production of sheep embryos

Summary: In this study in which the effects of maturation and fertilization media supplements and co-culturing on in vitro production of sheep embryos were investigated, primary oocytes (n=454) collected from ovaries of slaughtered ewes were used. Oocytes divided randomly into 4 groups were matured for 26 h in TCM 199 medium with different supplements: Group 1 (SH): TCM 199 medium supplemented by 20% sheep estrous serum, 10 $mu$g/ml FSH, 10 $mu$g/ml LH and 1 $mu$g/ml estradiol 17ß, Group 2 (S): TCM 199 medium supplemented by 20% sheep estrous serum, Group 3 (H): TCM 199 medium supplemented by 10 $mu$g/ml FSH, 10 $mu$g/ml LH and 1 $mu$g/ml estradiol 17ß, and Group 4 (M): TCM 199 medium without serum and hormones. After maturation, oocytes which were again divided into 3 subgroups were transferred in SOF medium supplemented by 2% (D), 5% (O) and 10% (Y) sheep estrous serum and fertilized in vitro for 18 h with fresh ram semen collected by electro-ejaculation and washed. After fertilization, oocytes were divided into 2 subgroups [Group 1 (KK): Co-culture with sheep oviductal epithelial cells; Group 2 (K): Culture without sheep oviductal epithelial cells] and cultured for 7 days. At the end of this period embryos were evaluated for their developments. The highest cleavage and morula rates were obtained in SH+Y+KK group (62.5% and 43.8%, respectively) and the lowest rates (8.7% and 4.3%, respectively) in M+D+K group in this study. According to the results, we concluded that supplementation of in vitro maturation media with 20% sheep estrous serum and hormones, in vitro fertilization media with 10% sheep estrous serum and co-culturing with sheep oviductal epithelial cells after fertilization could improve the cleavage and morula rates.

PDF

___

Byrd, S.R., FIores-Foxworth, G., Applewhite, A.A. and Westhusin, M.E. (1997): In vitro maturation of ovine oocytes in a portable incubator. Theriogenology, 47; 857-864.
Cognie, Y., Guerin, Y., Guyader, C, Poulin, N. and Crozet, N. (1990): In vitro fertilization of sheep oocytes matured in vivo. In: fertilization in mammals. Eds. B.D. Bavister, J. Cummins, E.R.S. Roldan. Serono Symposia, USA.
Cox, J.F. (1991): Effect of the cumulus on in vitro fertilization of in vitro matured cow and sheep oocytes. Theriogenology, 35; 191 (Abstr.).
Crozet, N., Ahmed-AIi, M. and Huneau, D. (1992): Estrous-sheep serum as a potent agent for ovine and caprine IVF. 12th. IntCong. on Anim. Repr., 1; 426-428.
Holm, P., Walker, S.K., Petersen, B.A., Ashman, R.J. and Seamark, R.F. (1994): In vitro vs. in vivo culture of ovine IVM-IVF ova: effect on lambing. Theriogenology, 41; 217 (Abstr.).
Madan, M.L., Naqvi, S.M.K., Chauhan, M.S., Singla, S.K. and Manik, R.S. (1992): In vitro production of ovine preimplantation embryos from in vitro matured oocytes using epididymal and frozen thawed spermatozoa. 12th. Int. Cong, on Anim. Repr., 3; 1318-1320.
Meinecke-Tillmann, S. and Meinecke, B. (1992): Establishment in culture of embryonic cell lines from small domestic ruminants. 12th. IntCong. on Anim. Repr., 2; 718-720.
Mogas, T., Izquierdo, M.D., Palomo, M J. and Paramio, M.T. (1995): Effect of hormones, serum source and culture system on the IVM and IVF of prepubertal goat oocytes and subsequent embryo development. Theriogenology, 43; 284 (Abstr.).
Naqvi, S.M.K., Madan, M.L., Manik, R.S., Chauhan, M.S. and Singla, S.K. (1992): In vitro development of ovine oocyte matured and fertilized in vitro to compact morula in co-culture system of oviductal cells and conditioned medium. 12th Int. Cong, on Anim. Repr., 3; 1327-1329.
O'Brien, J.K., Catt, S.L., Ireland, K.A., Maxwell, W.M.C. and Evans, G. (1997): In vitro and in vivo developmental capacity of oocytes from prepubertal and adult sheep. Theriogenology, 47; 1433-1443.
O'Brien, J.K., Rhodes, S.L., Maxwell, W.M.C. and Evans, G. (1994): Hormonal requirements for in vitro maturation of sheep oocytes. Theriogenology, 41; 266 (Abstr.).
Palomo, M.J., Mogas, T., Izquierdo, M.D^ and Paramio, M.T. (1995): Effect of heparin and sperm concentration of IVF of prepubertal goat oocytes. Theriogenology, 43; 292 (Abstr.).
Sevillano, C, Anel, L., De La Fuente, J., Alvarez, M., Celorrio, I., De Paz, P., Boixo, J.C. and Olmedo, J.A. (1997): In vitro development of sheep embryos derived of repeated laparoscopic foUiculoaspiration. Theriogenology, 47; 298 (Abstr.).
Stojanov,T., Robinson, S.J., Rhodes, S.L., O'Brien, J.K., Evans, G. and Maxwell, W.M.C. (1994): In vitro fertilization with chilled-stored ram spermatozoa.Theriogenology, 41; 302 (Abstr.).
Tervit, H.R., Pugh, P.A., McGowan, L.T., Bell, A.C.S. and Wells R.W. (1994): The freezability of sheep embryos is affected by culture system and source (in vivo or in vitro derived). Theriogenology, 41; 315 (Abstr.).
Walker, S.K., Hill, J.L., Bee, C.A. and Warnes, D.M. (1994): Improving the rate of production of sheep embryos using in vitro maturation and fertilization. Theriogenology, 41; 331 (Abstr.).