Kemal AK, İ. Kamuran İLERİ, Ümit CİRİT, Süleyman BACINOĞLU

Aygır spermasının dondurulmasında santrifüj işleminin ve seminal plazmanın etkileri

Konkur atı yetiştiriciliğinde kullanılan İngiliz melezi 3 aygırdan sun'i vajen yardımıyla toplam 16 ejakulat alındı. Sperma üç eşit hacime ayrıldı ve her hacim bir grubu oluşturdu. Birinci grubu oluşturan spermaya santrifüj işlemi uygulanmaksızın doğrudan 1:1 (sperma:sulandmcı) oranında süt tozu-glikoz sulandırıcısı ilave edildi. İkinci gruptaki sperma 1:1 oranında santrifüj medyumuyla sulandırıldı ve oda ısısında 500 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj işleminden sonra üstteki sıvı kısım 1:5 oranında alındı. Alman seminal plazma hacmi kadar süt tozu-glikoz sulandırıcısı ilave edilerek altta kalan sperma tortusu tekrar sulandırıldı. Üçüncü Grup spermaya önceden sulandırma işlemi uygulanmaksızın, ikinci grupta belirtildiği gibi santrifüj işlemi uygulandı. Üstteki sıvı kısım 1:5 oranında aspire edilerek yerine süt tozu-glikoz sulandırıcısı ilave edildi. Her üç grubu oluşturan spermalar final oranı 1:1 olmak üzere gliserollü sulandırıcı (final gliserol ve yumurta şansı oranı %4) 5'er dakika aralıklarla 10 eşit hacimde sulandırılmış spermaya ilave edildi. Belirtilen gliserolizasyon işleminden sonra sulandınlmış spermalar yine 5°C'de 2 saat ekilibrasyona bırakıldı. Sperma 0.25 mi payetlere çekilerek -110°C'de 7 dakikada donduruldu ve -196°'de sıvı azot içerisinde depolandı. Donma işlemi gerçekleştirildikten en az 3 gün sonra spermalar 37°C'lik su banyosunda 30 saniyede eritilerek spermatolojik özellikleri incelendi. Eritme sonrası morfolojik incelemeler için l payet, motilite incelemeleri için 3 payet eritildi. Çalışmada santrifüj işleminin aygır spermasına zarar verdiği, santrifüj öncesi spermanın sulandırılmasının bu zararlı etkiyi önemli oranlarda azalttığı saptandı. Üç aygınn genel ortalamaları dikkate alındığında seminal plazmanın eritme sonrası spermatozoon motilitesine ve akrozomal morfolojiye zarar verdiği bulundu. Aygırların bireysel özellikleri değerlendirildiğinde ise; seminal plazmanın; sperması donma prosedürlerine karşı zayıf olan aygırlarda donma yeteneğini olumsuz yönde etkilediği, sperması başarıyla dondurulan aygırda ise kısmen de olsa spermatozoon motilitesine zarar verdiği bulundu. Çalışmada; tohumlama dozundaki spermatozoon dozunu artırmada santrifüj işlemi ve sonrasında seminal plazmanın ortamdan uzaklaştırılmasının önerilebilir bir uygulama olduğu, santrifüj işlemi öncesi spermanın mutlaka sulandınlması gerektiği, donma çalışmalarında sperması zayıf olan aygırlarda seminal plazmanın zararlı olduğu, sperması başarıyla dondurulabilen aygırlarda ise seminal plazmanın eritme sonrası spermatozoon motilitesine ve akrozomal morfolojiye olumsuz yönde etkilemediği sonucuna varılmıştır.

Effect of centrifugation and seminal plasma on the freezing of stallion semen

Total 16 ejaculates were collected from 3 half-blood concure English Stallions by means of artificial vagina. The semen was divided into 3 portions and each volume established a group. The first group was extended by milk powder-glucose extender without centrifugation in a ratio 1:1 (semen extender). The second group was divided 1:1 with centrifugation medium and centrifuged at room temperature for 5 minutes at 500 rpm. Than the supernatant was taken in a ratio 1:5. Remaining semen precipitate is resuspended with the some amount of milk powder-glucose extender. The third group semen was centrifuged like group two without being extended before. Supernatant (1:5) was aspired and milk powder-glucose extender was added in the some amount. All three groups were cooled to 5°C gradually in 45 minutes. Glycerol containing extender (final glycerol and egg yolk rate 4%) was added to the semen at ratio 1:1 in 10 equal volumes with 5 minute intervals. After glycerolytation extended semen was left for equilibration for 2 hours at 5°C. Semen was filled in 0.25 ml. straws and frozen at -110°C for 7 minutes and start in liquid nitrogen at - 196°C. At least 3 days after freezing straws were thawed at 37°C for 30 seconds and spermatological characteristics were observed. One straw was thawed morphologic investigations and 3 straws for motility. At the end of the study, it was observed that centrifugation has harmful effect on stallion semen and pre-centrifugation extending of semen significantly prevents this effect. When the general averages of the three stallions were considered, it was observed that seminal plasma has deleterious effect on post-thaw spermatozoa motility and acrosomal morphology. When the individual characteristics of the stallions were considered, it was seen that seminal plasma negatively affect weak against freezing procedures and made a little harm on the motility of semen which were frozen successfully. At and of the study, we concluded that the spermatozoa number in an insemination dose is to be increased, removal of seminal plasma before and after centrifugation is a favourable method. However, semen has to be extended before centrifugation, seminal plasma is deleterious if the semen is weak against freezing procedures, and seminal plasma has no harmful effect on the post-thaw motility and acrosomal morphology of the semen which can be frozen successfully.

PDF

___

1. Ak, K., Özkoca, A., İleri, İ.K., Baran, A., Öztürkler, Y., Carioglu, B., Çelebi, M.(1994): Arap ve İngiliz aygırlarında spermatolojik özellikler. İstanbul Üniv.Vet.Fak.Derg. 20 (2- 3), 311-315.
2. Ak, K., Baran, A., Öztürkler, Y., Koç, M., İleri, İ.K. (1995): Arap aygırlarında seminal plazmanın spermatolojik özelliklere etkisi. Hayvancılık Arastırma Dergisi. 5, 1-2: 77-78.
3. Ak, K. (1998): Spermanın Muayenesi, In “Evcil Hayvanlarda Reprodüksiyon ve Sun’i Tohumlama”, Ed.İ.K. İleri, 75-90, İ.Ü. Veteriner Fakültesi Yayınları Masa Üstü Yayımcılık Ünitesi, Ders notu No: 84.
4. Ak, K., Baran, A., Soylu, M.K., İleri, İ.K. (1998): The effect of bull seminal plasma to the ram semen extenders on spermatological charecteristics after thawing. Ninth National Conference Modern Tendencies in the development of fundamental and applied sciences. June 4-5, 431-435, Stara Zagora, Bulgaria.
5. Aurich,J.E., Kühne, A., Hoppe, H., Aurich,C. (1996): Seminal plasma affects membrane integrity and motility of equine spermatozoa after cryopreservation. Theriogenology 46: 791-797.
6. Bedford, S.J., Graham, J.K., Amann, R.P., Squires, E.L., Pickettt, B.W. (1995): Use of two freezing extenders to cool stallion spermatozoa to 5°C with and without seminal plasma. Theriogenology. 43: 939-953.
7. Bedford, S.J., Jasko, D.J., Graham, J.K., Amann, R.P., Squires, E.L., Pickett, B.W. (1995): Effect of seminal exrenders containing egg yolk and glycerol on motion characteristics and fertility of stallion spermatozoa. Theriogenology. 43,955-967. (2.1.1.3)
8. Brandona,C.L., Heusnerc, G.L., Caudlea, A.B., Fayrer-Hosken r.A. (1999): Twodimensionel polyacrylamide gel electrophesis of equine seminal plasma proteins and their correlation with fertility. Theriogenology. 52, 863-873.
9. Evrim, M, Günes, H. (2000): Biyometri Ders Notları. İ.Ü. Veteriner Fakültesi Yayınları Masa Üstü Yayımcılık Ünitesi, Ders notu No: 113.
10. Franci, A.T., Amann, R.P., Squires, E.L., Pickett, B.W. (1987): Motility and fertility of equine spermatozoa in milk extender after 12 or 24 hours at 20 .Theriogenology. 27,517- 525.
11. Jasko, D.J., Moran, D.M., Farlin, M.E., Squires, E.L. (1991): Effect of seminal plasma dilution or removal on spermatozoal motion charecteristics of cooled stallion semen. Theriogenology.35 (6):1059-1067.
12. Kreider,J.L., Tindall,W.C., Potter,G.D.(1985): Inclosion of bovine serum albumin in semen extenders to enhance maintenance of stallion sperm viability. Theriogenology. 23(2): 399-408.
13. Pickett, B.W., Sullivan, J.J., Byers, W.W., Pace, M.M., Remmenga, E.E. (1975): Effect of centrifugation and seminal plasma on motility and fertility of stallion and bull spermatozoa. Fertil. Steril. 26: 167-174.
14. Varner, D.D., Blanchard, T.L., Love, C.l., Garcia, M.C., Kenney, R.M. (1987): Effects of semen fractionation and dilution ratio on equine spermatozoal motility. Theriogenology. 28; 709-723.
15. Wöckener, A., Colenbrander, B. (1993): Liquid storage and freezing semen from New Forest and Wells Pony stallions. Dtsch.tierärztl.Wschr. 100, 125-136.