Yaygın Salmonella Serovarlarının Moleküler Tekniklerle Tiplendirilmesi
Bu çalışmanın amacı, Veteriner Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü (VKMAE), Bakteriyolojik Teşhis Laboratuvarı sorumluluğunda 2009-2011 yılları arasında Salmonella Prevalans çalışması kapsamında, Kauffmann-White serotiplendirme şeması ile tiplendirmesi yapılan toplam 907 Salmonella izolatının, serogrup Salmonella multiplex- PZR, Faz 1 Salmonella multiplex-PZR ve Faz 2 Salmonella multiplex-PZR kullanarak sahada yaygın olarak sirküle olan Salmonellla serovarları için dizayn edilen primerler ile maksimum 2-3 gün gibi kısa sürede, düşük maliyetle tiplendirmesini yapabilmektir. Bu çalışmayla, konvansiyonel yöntemle faz 1 ve faz 2 antijenlerinin eş zamanlı sergilenmemesi sonucunda ekstra laboratuvar iş yükü, olası çarpraz reaksiyonlar sebepli ekstra antiserum harcanması dolayısıyla yaşanılan zaman kaybı ve yüksek maliyetin üstesinden gelineceği öngörüldü. Ayrıca, 2 testin (multiplex-PZR ve konvansiyel serotiplendirme) örtüşmediği durumlar bakterilerin 6.5 kb operonunu inceleyen ribotiplendirme desteğiyle çözülmesi yoluna gidilmiştir. Çalışmada kullanılacak primerler ile 907 izolatın % 29.32’sinin (266 izolat; 15 farklı serovar) üç antijenik yapısı da tam olarak identifiye edilip, isimlendirilebilmiştir. İncelenen izolatların somatik, flagellar 1 ve flagellar 2 antijenlerinin sırasıyla; %54.56 (490), %90.95 (825) ve %78.94 (716)’ü tespit edilebilmiştir. İzolatların en azından % 50’sinin tam olarak isimlendirilebileceği öngörülmüştür ancak Salmonella Infantis (S. Infantis) ve S. Mbandaka suşarında somatik antijeni amplifiye eden primer olmasına rağmen somatik antijen tespit edilememiştir. Bu suşlar ribotiplendirmeye alınmıştır. Konvansiyonel seroloji, multiplex-PZR ve ribotiplendirme değerlendirildiğinde; ribotiplendirme ve multiplex-PZR’ların gold standart metoda destek metodlar olarak kullanabileceği tespit edilmiştir. Özet olarak; çalışmada mevcut olan primerler sadece sahada yaygın olan serovarların somatik, faz 1 ve faz 2 antijenlerine spesifik oldukları için PZR tüm serovarları identifiye etmekte yetersiz kalmıştır. Sonuç olarak ucuz, hızlı ve duyarlı metot olan multiplex-PZR’ların belirli somatik, flagellar 1 ve 2 antijenlerinin tespitinde konvansiyonel serolojik yönteme destek olarak kullanılabileceği kanısına varılmıştır.
___
- 1. Aarts HJ, LA Van Lith, J. Keijer, (1998). High resolution
genotyping of Salmonella strains by AFLP-fingerprinting.
Lett Appl Microbiol, 26, 131-135.
2. Bastin DA, Reeves PR, (1995). Sequence and Analysis of
the O antigen gene (rfb) cluster of Escherichia coli O111.
Gene, 16, 17-23.
3. Bayindir Bilman F, Gunaydin E, Turhanoglu M, Akkoc A,
(2014). The Value of PCR Method in the Species-Level
Identification of a Mucoid Salmonella sp. Strain Isolated
from the Urine Culture of a Case with Asymptomatic
Nephrolithiasis. Mikrobiol Bul, 48(1), 151-159.
4. Echeita MA and Usera MA, (1998). Rapid Identification of
Salmonella spp. phase 2 antigens of the H1 antigenic complex
using ‘multiplex PCR’. Res Microbiol, 149, 757-761.
5. Echeita MA, Herrera S, Garazier J and Usera MA, (2002).
Multiplex PCR- based detection and identification of the
most common Salmonella-second-phase flagellar antigens.
Research in Microbiol, 153, 107-113.
6. Fitzgerald C, Sherwood R, Gheesling LL, Brenner FW,
Fields PI, (2003). Molecular analysis of the rfb O antigen
gene cluster of Salmonella enterica serogroup O:6,14
and development of a serogroup-specific PCR assay. Appl
Environ Microbiol, 69(10), 6099-105.
7. Grazier J, Lopez-Molina N, Laconcha I, Bagessen DL,
Rementeria A, Vivanco A, Audicana I, Perales A, (2000).
Suitable of PCR fingerprinting, Infrequent-Restriction-Site
PCR, and Pulsed-Field Gel Electrophoresis, combined with
computerized gel analysis, in library typing of Salmonella
enterica serovar Enteritidis. Appl Environ Microbiol, 66,
5273-5281.
8. Guibourdenche M, Roggentin, P Mikoleit M, Fields PI,
Bockemühl J, Grimont PA.D, Weill François-Xavier,
(2010). Supplement 2003-2007 (No. 47) to the White-
Kauffmann-Le Minor scheme. Res Microbiol, 161(1), 26-9.
9. Herrera-Leon S, McQuiston JR, Usera MA, Fields PI,
Garazier J and Echeita MA, (2004). Multiplex PCR for
Distinguishing the Most Common Phase-1 Flagellar
Antigens of Salmonella spp. J Clin Microbiol, 42(6), 2581-
2586.
10. Herrera-Leon S, Ramiro R, Arroyo M, Diez R, Usera MA,
Echeita MA, (2007). Blind comparison of traditional serotyping
with three multiplex PCRs for the identification
of Salmonella serotypes. Research in Microbiology, 158,
122-127.
11. Hong Y, Liu T, Lee MD, Hofacre CL, Maier M, White DG,
Ayers S, Wang L, Berghaus R, Maurer JJ, (2008). Rapid
screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis,
Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologicallycorrelative
allelotyping PCR targeting the O and H antigen
alleles, BMC Microbiol, 8, 178.
12. Lindstedt BA, Heir E, Vardund T, Kapperud G, (2000).
Fluorescent amplified-fragment length polymorphism genotyping
of Salmonella enterica subsp. enterica serovars
and comparison with pulsed-field gel electrophoresis typing.
J Clin Microbiol, 38, 1623-1627.
13. Lino T, (1997). Genetics of structure and function of bacterial
flagella. Anu Rev Genet, 11, 161-182.
14. Luk JM, Kongmuang U, Reeves PR, Lindberg AA, (1993).
Selective amplification of abequose and paratose synthase
genes (rfb) by polymerase chain reaction for identification
of Salmonella major serogroups (A, B, C2, and D). J Clin
Microbiol, 31, 2118-2123.
15. Marolda CL, Vicarioli J, Valvano MA, (2004). Wzx proteins
involved in biosynthesis of O antigen function inassociation
with the first sugar of O specific lipopolisaccharide subunit.
Microbiology, 150, 4095-4105.
16. Newton S, MRD Wasley, A Wilson, LT Rosenberg, JF
Miller, and BA Stocker, (1991). Segment IV of a Salmonella
flagellin gene specifies flagellar antigen epitopes. Mol
Microbiol, 5, 419-425.
17. Patrick AD Grimont & François-Xavier Weill, (2007).
Kauffmann-White Scheme Antigenic formulae of the
Salmonella serovars, 9th edition, Institut Pasteur, 28 rue du
Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
18. Ranjbar R, Mortazavi SM, Mehrabi Tavana A, Sarshar
M, Najafi A, Soruri Zanjani R, (2017), Simultaneous
Molecular Detec-tion of Salmonella enterica Serovars
Typhi, Enteritidis, Infantis, and Typhimurium. Iran J Public
Health, 46(1),103-111.
19. Reeves MW, Evins GM, Heiba AA, Plikaytis BD, Farmer
JJ, (1989). Clonal nature of Salmonella typhi and its genetic
relatedness to other salmonellae as shown by multilocus
enzyme electrophoresis, and proposal of S. bongori comb. J
Clin Microbiol, 35, 2786-2790.
20. Samuel G, Reeves PR, (2003). Biosynthesis of O-antigens:
genes and pathways involved in nucleotide sugar precursor
synthesis and O-antigen assembly, Carbohydr Res, 338,
2503-2519.
21. Shah DH, Park JH, Cho MR, Kim MC, Chae JS, (2005).
Allele-specific PCR method based on rfbS sequence for distinquishing
Salmonella gallinarum from Salmonella pullorum:
serotype-specific rfbS sequence polymorphism. J Clin
Microbiol, Methods, 60, 169-177.
22. Şahan Ö, Müştak K, Torun E, Akan M, Diker S. Salmonella
Infantis tanısında ribtiplendirme ve serotiplendirme yöntemlerinin
karşılaştırması. 10. Uluslararası Veteriner
Hekimleri Mikrobiyoloji Kongresi, 24-27 Eylül 2012,
Kuşadası, AYDIN
23. Wei LN, and TM Joys, (1995). Covalent structure of three
phase-1 flagellae filament proteins of Salmonella spp. J
Mol Biol, 186, 791-803.
24. Zappelini L, Martone-Rocha S, Dropa M, Matté MH, Tiba
MR, Breternitz BS, Razzolini MT, (2017). Effective characterization
of Salmonella Enteritidis by most probable
number (MPN) followed by multiplex polymerase chain
reaction (PCR) methods, Environ Sci Pollut Res Int, 24(5),
4828-4834.
25. Zieg J, Silverman M, Hilmen M and Simon M, (1977).
Recombinational switch for gene expression. Science, 196,
170-172.