Çanakkale ili börülce üretim alanlarında Hıyar mozaik virüsü (Cucumber mosaic virus; CMV)’nün tespiti ve kılıf protein genine göre moleküler karakterizasyonu

Bu çalışma kapsamında 2015-2016 yıllarında Çanakkale ilinin börülce ve fasulye yetiştiriciliği yapılan alanlarına arazi çıkışları yapılarak virüs ve virüs benzeri belirtiler gösteren 14 fasulye, 8 börülce olmak üzere toplam 22 bitkiden örnekler alınmıştır. Toplanan örnekler Hıyar mozaik virüsü (Cucumber mosaic virus; CMV) varlığını belirlemek için DAS-ELISA ile testlenmiş ve 6 örnek CMV ile enfekteli bulunmuştur. Enfekteli bulunan tüm örnekler börülce bitkisinden elde edilirken, fasulye bitkilerinde enfeksiyon tespit edilememiştir. Elde edilen CMV izolatlarının kılıf protein (CP) gen bölgesi, gen spesifik primerler kullanılarak çoğaltılmış ve izolatların tamamında 638 bp büyüklükte CP genine spesifik ürün elde edilmiştir. CMV izolatları arasından CWP17 tesadüfi olarak seçilerek RT-PCR ürünleri purifiye edilmiş ve kısmi baz dizisi analizi gerçekleştirilmiştir. CWP17 izolatına ait sekans verisi KY474380 erişim numarası ile gen bankasına kaydedilmiştir. Gerçekleştirilen çoklu dizi analizleri sonucunda CWP17 izolatının dünya CMV izolatları ile nükleotid düzeyinde %80-99, aminoasit düzeyinde ise %90-100 benzerlik gösterdiği saptanmıştır. Oluşturulan filogenetik ağaçlar ile de CWP17 izolatının alt grup IB’de yer aldığı belirlenmiştir. Gerçekleştirilen bu çalışma ile Türkiye’de ilk defa CMV enfeksiyonu ticari börülce üretim alanlarında tespit edilmiştir. Ayrıca ülkemizde ilk kez baklagil üretim alanlarında CMV enfeksiyonunun moleküler karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.

Anahtar Kelimeler:

DAS-ELISA, RT-PCR, filogenetik, sekans analizi, CP

Detection and molecular characterization based on coat protein gene of Cucumber mosaic virus (CMV) from cowpea production fields of Çanakkale province in Turkey

In 2015-2016, surveys were carried out in areas of Çanakkale province where cowpea and bean were cultivated. Twenty-two samples (14 bean and 8 cowpea) showing virus and virus-like symptoms were collected from these areas. The collected samples were tested by DAS-ELISA to determine the presence of Cucumber mosaic virus (CMV) infection and 6 samples out of 22 were found to be infected with CMV. While the determined all CMV infection was found in cowpea samples, there was no infection found in bean samples. Coat protein (CP) gene of samples infected with CMV was amplified with RT-PCR and corresponding bands of 638 bp were obtained from all of them. RT-PCR products of CWP17 isolate chosen from infected samples randomly was purified and sequenced. Sequence data of CWP17 isolate was deposited (accession number: KY474380) in GenBank. Results of multiple sequence alignment analysis, CWP17 isolate was found to be identical 80-99% and 90-100% with world CMV isolates in nucleotide and amino acid level, respectively. Also, CWP17 isolates was found in Subgroup IB accordingly phylogenetic tree created. With carrying out this study, CMV infection was the first time detected in commercial cowpea production areas in Turkey. In addition, the first molecular characterization work was carried out in legume production areas of Turkey.

Keywords:

DAS-ELISA, RT-PCR, phylogenetic, sequencing, CP,

PDF

___

Beler Ö. ve Açıkgöz S. 2005. Ege ve Marmara Bölgelerindeki zeytin fidanlıkları ve ağaçlarında görülen bazı virüs hastalıklarının ELISA testi ile saptanması. ADÜ Ziraat Fakültesi Dergisi, 2 (1), 79–84.
Çağlar B.K. 2006. Hıyar mozaik virüsü (CMV)’nün kavun (CMV-K), domates (CMV-D), biber (CMV-B) izolatlarının biyolojik, serolojik, moleküler yöntemlerle karakterizasyonu ve satellit RNA’lerin virüs üzerindeki etkisi. Fen Bilimleri Enstitüsü, Çukurova Üniversitesi, Doktora Tezi, 89s.
Clark M.F. and Adams A.N. 1977. Characteristics of the microplate method of enzymelinked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34, 475-483.
Çulal-Kılıç H. ve Yardımcı N. 2012. Burdur Çine Ovası fasulye alanlarında Hıyar mozaik virüsü. Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 3 (2), 12- 15.
Ergun M., Semih E. and Paylan I.C. 2013. Cucumber mosaic virus in globe artichoke in Turkey. Canadian Journal of Plant Pathology, 35 (4), 514-517.
Erkan S., Gümüş M., Paylan İ.C., Duman İ. ve Ergün M. 2013. İzmir ili ve çevresindeki bazı kışlık sebzelerde görülen viral etmenlerin saptanması. Ege Üniv. Ziraat Fak. Derg., 50 (3): 311-322.
Eyvazi A., Dizadji A., Rastgou M. and Koohi-Habibi M. 2015. Bioassay and phylogeny of five Iranian isolates of Cucumber mosaic virus from different hosts based on CP gene sequence. Plant Protection Science, 51 (4), 200–207.
Gökdağ S., Karanfil A. ve Korkmaz S. 2016. Çanakkale ili ıspanak alanlarındaki Şalgam mozaik virüsü ve Hıyar mozaik virüsü varlığının belirlenmesi. Bahçe, özel sayı (cilt II), 166-170.
Gümüş M., Erkan S. ve Tok S. 2004. Bazı kabakgil türlerinin tohumlarındaki viral etmenlerin saptanması üzerinde araştırmalar. Ege Üniv. Ziraat Fak. Derg., 41 (1), 49-56.
Güzel O. and Arlı-Sökmen M. 2003. Determination of some viruses infecting common bean (Phaseoulus vulgaris L.) and their incidences in seed lots in Samsun province. J. Turk. Phytopathology, 32 (2), 99-106.
Karanfil A., Soylu B. ve Korkmaz S. 2016. Çanakkale ili ve ilçelerindeki soğanlı süs bitkilerinde Hıyar mozaik virüsü enfeksiyonunun serolojik ve moleküler yöntemler ile araştırılması. Trakya University Journal of Natural Sciences, 17 (2), 105-110.
Kilic C.H., Yardimci N., Acikyureki S. and Uzal A. 2015. Detection of BCMV, AMV and CMV by DAS-ELISA and immunocapture-RT-PCR in bean-growing areas in the West Mediterranean Region, Turkey. Fresenius Environmental Bulletin, 24 (5), 1752-1756.
Kumar S., Stecher G. and Tamura K. 2016. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 For Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution., 33, 1870-1874.
Kutluk-Yılmaz N.D., Gümüş M. ve Erkan S. 2002. Tokat ilinde fasulye tohumlarındaki viral etmenlerin saptanması üzerinde araştırmalar. Ege Üni. Ziraat Fak. Derg., 39 (3), 49-55.
Mohammadi K., Hajizadeh M. and Koolivand D. 2016. Detection and identification of four vegetable fruit viruses in West and Northwest of Iran. Iranian Journal of Plant Pathology, 52 (2), 279-288.
Muhire B.M., Varsani A. and Martin D.P. 2014. SDT: A virus classification tool based on pairwise sequence alignment and identity calculation. Plos One, 9 (9), 1-8.
Nouri S., Arevalo R., Falk B.W. and Groves R.L. 2014. Genetic structure and molecular variability of Cucumber mosaic virus isolates in the United States. Plos One, 9 (5), e96582.
Ohshima K., Matsumoto K., Yasaka R., Nishiyama M., Soejima K., Korkmaz S., Ho S.Y.W., Gibbs A.J. and Takeshita M. 2016. Temporal analysis of reassortment and molecular evolution of Cucumber mosaic virus: Extra clues from its segmented genome. Virology, 487, 188–197.
Palukaitis P. and Garcia-Arenal F. 2003. Cucumber mosaic virus. AAB. Descriptions of Plant Viruses, No: 400.
Palukaitis P., Roossinck M.J., Dietzgen R.G. and Francki R.I. 1992. Cucumber mosaic virus. Advances in Virus Research, 41, 281-348.
Paylan I.C., Erkan S., Cetinkaya N., Ergun M. and Pazarlar S. 2014. Effects of different treatments on the inactivation of various seedborne viruses in some vegetables. Ozone-Science & Engineering, 36 (5), 422-426.
Roossinck M.J. 2002. Evolutionary history of Cucumber mosaic virus deduced by phylogenetic analyses. Journal of Virology, 76 (7), 3382–3387.
Roossinck M.J., Zhang L. and Hellwald K.H. 1999. Rearrangements in the 5' nontranslated region and phylogenetic analyses of Cucumber mosaic virus RNA 3 indicate radial evolution of three subgroups. Journal of Virology, 73 (8), 6752-6758.
Salem N.M., Ehlers J.D., Roberts P.A. and Ng J.C.K. 2010. Biological and molecular diagnosis of seedborne viruses in cowpea germplasm of geographically diverse SubSaharan Origins. Plant Pathology, 59, 773–784.
Sarı S. 2015. Samsun ilinde yetiştirilen yazlık sebzelerde enfeksiyon oluşturan Cucumber mosaic virus (CMV) izolatlarının karakterizasyonu ve konukçu-simptom-satellit RNA ilişkilerinin araştırılması. Fen Bilimleri Enstitüsü, Ondokuz Mayıs Üniversitesi, Yüksek Lisans Tezi, 89s.
Sertkaya G. 2015. Hatay ili marul ve ıspanak alanlarında bazı virüslerin araştırılması. Mustafa Kemal Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Dergisi, 20 (1), 7-12.
Zhu F., Sun Y., Wang Y., Pan H., Wang F., Zhang X., Zhang Y. and Liu J. 2016. Molecular characterization of the complete genome of three basal-BR isolates of Turnip mosaic virus infecting Raphanus sativus in China. International Journal of Molecular Sciences, 17, 888; doi:10.3390/ijms17060888.
Zitter T.A. and Murphy J.A. 2009. Cucumber mosaic virus. The Plant Health Instructor, DOI: 10.1094/PHI-I-2009-0518-01.