Koyunlarda Maternal Plazmadan Fötal Cinsiyet Tayininde Fenol-Kloroform İzolasyon Metodu İle İki Farklı Ticari İzolasyon Kitinin Kullanılabilirliği
Koyunlarda fötal cinsiyetin belirlenmesinde kullanılan yöntemlerden biri maternal plazmadaki fötal DNA’ların Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmasına dayanır. Ancak, maternal plazmadan izole edilen DNA miktarı ve kalitesi, kullanılan DNA izolasyon yöntemine göre önemli ölçüde değişebilmektedir. Bu çalışmada, üç farklı DNA izolasyon metoduyla koyun maternal plazmasından izole edilen DNA’ların PZR ile çoğaltılarak fötüs cinsiyetlerinin belirlenmesi amaçlandı. Bu amaçla, gebeliğin 20. haftasındaki 13 adet koyundan plazma örnekleri alındı ve doğum sonrası yavruların cinsiyetleri doğrulandı. Pozitif kontrol amacıyla iki adet koç plazması, negatif kontrol amacıyla ise iki adet gebe olmayan koyun plazması kullanıldı. Maternal plazmadan fenol-kloroform izolasyon metodu ve iki farklı ticari nükleik asit izolasyon kiti (QIAamp ve FitAmp) kullanılarak DNA izole edildi. İzole edilen DNA örneklerinden X ve Y kromozomları üzerindeki Amelogenin ve SRY (Sex-determining Region Y) genlerinin hedef bölgeleri PZR yöntemi ile çoğaltıldı. Ticari nükleik asit izolasyon kitleriyle elde edilen DNA’lardan SRY ve Amelogenin primerleri ile yapılan farklı PZR işlemlerinde fötüs cinsiyetinin belirlenmesine yönelik spesifik PZR ürünleri elde edilemedi. Diğer taraftan, fenol-kloroform izolasyon metoduyla izole edilen DNA örneklerinden 10’unda (7 erkek ve 3 dişi fötal DNA içeren örnekte) fötüs cinsiyeti doğru bir şekilde teşhis edildi (10/13). Ancak erkek fötüs taşıyan üç koyundan elde edilen DNA örneklerinden erkek cinsiyet teşhisine özgü PZR ürünleri elde edilemedi (3/13). Çalışmanın sonuçları koyunlarda maternal plazmadan DNA izolasyonunda iki farklı ticari nükleik asit izolasyon kiti kullanıldığında fötal cinsiyetin tespit edilemediğini, diğer taraftan fenol-kloroform izolasyon metodu ile fötal cinsiyet teşhisi yapılabildiğini, ancak bu metodun da hatalı sonuçlara neden olabildiğini göstermiştir.
Suitability of Two Different Commercial Isolation Kits and Phenol-Chloroform Isolation Method for Fetal Sex Determination from Maternal Plasma in Sheep
One of the methods used for determining fetal sex in sheep depends on amplification of fetal DNA in maternal plasma by polymerase chain reaction (PCR). However, quantity and quality of the DNA isolated from the maternal blood plasma can vary significantly depending on the DNA isolation method used. In this study aimed to determine fetal sex in maternal blood plasma by using three different DNA isolation methods. Plasma samples were collected from 13 ewes at 20th week of pregnancy and the genders of the fetuses were confirmed after birth. Plasma samples were collected from two rams as positive control and from two non-pregnant ewes as negative control. Free circulating DNA in maternal plasma samples was isolated by using phenol-chloroform isolation method and two different commercial DNA isolation kits (QIAamp and FitAmp). The obtained free circulating DNA was used for amplifying the target regions of X- and Ychromosome specific Amelogenin and SRY (Sex-determining Region Y) genes, respectively. Commercial isolation kits did not yield a PCR product of SRY or Amelogenin genes. On the other hand, the fetal sex correctly identified in 10 DNA samples (in three female and seven male fetal DNA including samples) isolated by using phenol-chloroform isolation method (10/13). However, in three samples including male fetal DNA fetal sex were incorrectly identified (3/13), because male sex specific PCR products were not obtained. The results of the study suggested that detection of fetal sex in sheep could not be achieved when two different commercial DNA isolation kits were used for DNA isolation from maternal plasma while phenol-chloroform isolation method was successful for this purpose, although incorrect results could also be obtained when this method was used.
