Mehveş Poda, Buşra Gizem Hasanoğulları, Fatma Yeliz Ekici, Feyza Nur Tuncer

Adacık Benzeri Hücre Kümeleşmesinde Gen Anlatım Değişimleri

Amaç: PANC-1 hücre hattı ekzokrin pankreastan kaynaklı, insüline proliferatif tepki veren birkanser hücre hattıdır ve bu hücrelerde PDX1, KLF4 ve OCT4 transkripsiyon faktörlerinin endojenolarak gen anlatımının varlığı daha önce de bildirilmiştir. Bu hücreler özel kültür şartları altındaindüklendiklerinde, pankreatik hormon üreten adacık-benzeri hücre kümeleşmeleri (AHK)oluşturabilirler. Üç boyutlu yapılar olan AHK oluşumlarının, metabolik yolakların da incelenebileceğibir hücresel model olabileceği öngörüsüyle, SST, GCG, PDX1, KLF4 ve OCT4 gen anlatımdüzeylerindeki değişimlerini karakterize etmeyi amaçladık.Yöntem: Bazal kültür şartları ile AHK protokolü uygulanmış hücrelerdeki gen anlatımdüzeylerinin karşılaştırılabilmesi amacıyla, hücre lizatlarından total RNA eldesi yapıldı. Daha sonracDNA elde edilerek SYBR-Green kullanımıyla SST, GCG, PDX1, KLF4 ve OCT4 gen anlatım düzeylerigerçek zamanlı PCR metoduyla belirlendi. Gen anlatım farkı, PPIA geni normalizasyon referansıalınarak DDCt metodu kullanıldı ve istatistik anlamlılıklar düzeyleri two paired ANOVA metodu ilehesaplandı.Bulgular: Bazal şartlara göre karşılaştırma yapıldığında, indüklenmiş AHK oluşumlarının 24 ve336’ıncı saatlerinde, Glukagon (GCG) (p=0.2) ekspresyonunun hafifçe azalarak sabit kaldığı, ancak budeğişimin anlamlı olmadığı saptandı. Buna karşılık, Somatostatin (SST) (p=0.0014) gen anlatımındabazale göre, 24’üncü saatte 2.3 kat, 336’ıncı saatte 10.82 kat artış saptandı. PDX1 (P=0.02) ve KLF4(P=0.15) gen anlatımları bazala göre düşmekte ve sabit kalmaktaydı. OCT4 (P=0.03) gen anlatımı iseönce düşmesine rağmen daha sonra 2.8 kat yükselmekteydi.Sonuçlar: AHK oluşumu sonucunda özellikle SST gen anlatımının yükseldiği saptanmış olması oluşanhücre kümeleşmelerinin ağırlıkla Langerhans delta hücresi benzeri karakterlere sahip olabileceğineişaret etmektedir. Bu ön bulgular oluşan deneysel modelin faydalı bir model olarak kullanılacağınaişaret etmektedir.

Anahtar Kelimeler:

PANC-1, Adacık Benzeri Kümeleşme (AHK), SST, GCG, PDX1, KLF4, OCT4

Differential Expression in SST Gene in Induced PANC-1 Cells Forming Islet-Like Cell Aggregates (ICA)

Objectives: The PANC-1 cell line is a cancer cell line, which is derived from pancreatic ductal humancarcinoma cells, can give a proliferative response to insulin and PDX1, KLF4 ve OCT4 transcriptionfactors are known to be expressed endogenously. When induced in cell culture, these cells may formislet cell-like aggregates (ICA), expressing pancreatic hormones. We aimed to characterize the changesin the expression of SST, GCG, PDX1, KLF4 ve OCT4 genes, with the provision that ICAs having threedimensional cellular stuructures, may be used as a model system for studying metabolic pathways inthe future.Materials and Methods: In order to be able to compare the gene expression levels in basal cultureconditions with the ICA forming protocol, RNA was extracted from cell lysates. After cDNA syntesis,SST, GCG, PDX1, KLF4 ve OCT4 gene expression was determined by using SYBR-Green. PPIA was usedas housekeeping gene and the fold differences were calculated by using 2-DDCt method.Results: When taking the basal conditions as reference, glucagon (GCG) (p=0.2) expression wasfirst slightly reduced and stayed stable at 24th and 336th hr timepoints in the induced ICA formations.In spite of this, somatostatin (SST) (p=0.0014) gene expression was upregulated 2.3 fold at 24th hr.and 10.82 fold at 336th hr. The expression of PDX1 (P=0.02) and KLF4 (P=0.15) gene expressions werereduced and stayed stable. OCT4 (P=0.03) gene expression was first reduced whreas it was rising to2.8 fold.Conclusion: The upregulation of SST gene expression indicates that the ICA formations containrather Langerhans delta cells-like characteristics. Our preliminary data suggested that this experimentalmodel be utilized for the future research purposes.

Keywords:

PANC-1, Islet-Like Cell Aggregates (ICA), MYC, PDX1, KLF4, OCT4,

PDF

___

1. Lieber M, Mazzetta J, Nelson-Rees W, Kaplan M, Todaro G. Establishment of a continuous tumor-cell line (PANC-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. Int J Canc 1975; 15: 741-747. 2. Arda HE, Benitez CM, Kim SK. Gene Regulatory Networks Governing Pancreas Development. Dev Cell 2013; 25: 5-13. 3. Hale MA, Kagami H, Shi L et al. The homeodomain protein PDX1 is required at mid-pancreatic development for the formation of the exocrine pancreas. Dev Biol 2005; 286: 225-237. 4. Johnson JD, Ahmed NT, Luciani DS, Han Z, Tran H,3 Fujita J, Misler S, Edlund H, Kenneth S. Polonsky KS. Increased islet apoptosis in Pdx1+/– mice. J Clin Invest 2003; 111:1147-1160. 5. Shi M, Cui J, Du J5, Wei D, Jia Z, Zhang J, Zhu Z, Gao Y, Xie K. Novel KLF4/LDHA Signaling Pathway Regulates Aerobic Glycolysis in and Progression of Pancreatic Cancer, Clin Cancer Res. 2014; 20(16): 4370-4380. doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-0186. 6. Lin H , Sun L-H, Han W, He T-Y, Xu X-J, Cheng K, Geng C, Su L-D, Wen H, Wang X-Y, Chen Q-L. Knockdown of OCT4 suppresses the growth and invasion of pancreatic cancer cells through inhibition of the AKT pathway, Mol Med Rep 2014; 9: 1335-1342. 7. Hardikar AA, Marcus-Samuels B, Geras-Raaka E, Raaka BM, Gershengorn MC. Human pancreatic precursor cells secrete FGF2 to stimulate clustering into hormone expressing islet-like cell aggregates. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100:7117-7122. 8. Teitelman G, Lee JK Cell lineage analysis of pancreatic islet development: glucagon and insulin cells arise from catecholaminergic precursors present in the pancreatic duct. Dev Biol 1987; 121:454–466. 9. Hauge-Evans AC, King AJ , Carmignac D, Richardson CC, Robinson ICAF, Low MJ, Christie MR, Persaud SJ, Jones PM. Somatostatin Secreted by Islet δ-Cells Fulfills Multiple Roles as a Paracrine Regulator of Islet Function. Diabetes 2009; 58(2): 403-411