Klinik Örneklerden İzole Edilen Aspergillus Türlerinin Tanımlanmasında Geleneksel Yöntemler, MALDI-TOF MS ve Dizi Analizi Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Amaç: Aspergillus tuǅruǅ mantar enfeksiyonları immuǅn sistemi baskılanmış hastalarda, yuǅksek mortalite ve morbidite ile sonuçlanan invazif hastalıklara yol açmaktadır. Bu nedenle hızlı ve dogǍru tanı konularak uygun antifungal tedavi başlanması invazif aspergillozlu hastalar için hayati oǅneme sahiptir. Guǅnuǅmuǅzde daha hızlı, kolay uygulanabilir, yuǅksek duyarlılık ve oǅzguǅlluǅgǍe sahip yeni tanı yoǅntemleri tercih edilmektedir. Bu çalışmada çeşitli klinik oǅrneklerden izole edilen Aspergillus tuǅrlerinin; geleneksel yoǅntemler, MALDI-TOF MS sistemi ve DNA dizi analizi yoǅntemi kullanılarak tanımlanması ve bu yoǅntemlerin karşılaştırılması amaçlanmıştır. Yoǅntemler: Bu çalışmada çeşitli klinik oǅrneklerden izole edilen toplam 50 Aspergillus izolatı çalışmaya dahil edildi. Aspergillus suşlarından 2 tanesi kontaminasyondan dolayı çalışma dışı bırakıldı. Bulgular: Çalışmamızda referans tanımlama yoǅntemi olarak kullandıgǍımız ITS boǅlgesinin dizi analiziyle, suşların 25 tanesi A.fumigatus tuǅr kompleksi (%52,08), 17’si A.flavus tuǅr kompleksi (%35,42), 3’uǅA.niger tuǅr kompleksi (%6,25), 2’si A.terreus tuǅr kompleksi (%4,17), 1’i A.sydowii tuǅr kompleksi (%2,08) olarak tanımlandı. Altın standart yoǅntemin dizi analizi olduğu ve geleneksel yöntem ile karşılaştırıldığında %97,9 uyum olduğu gözlendi. İki farklı yazılım kullandığımız MALDI-TOF MS sisteminde ise güncel IVD (invitro diagnostik) VITEK MS V.2.0 yazılımı ile doğru tanımlanan köken 37(%77,1) iken SARAMIS 4.12 RUO yazılımı ile doğru tanımlanan köken 42(%87,5) olarak bulundu. Sonuç: Moleküler yöntemler, geleneksel yöntemlerin yetersiz kaldığı ve tür tanımının yapılamadığı durumlarda tamamlayıcı yöntem olarak kullanılabilir. Zaman açısından değerlendirildiğinde MALDI-TOF yöntemi hızlı ve duyarlı bir yöntem olmasına rağmen veri tabanının geliştirilmesi amacıyla suş sayısının arttırılarak bu tür çalışmaların tekrarlanması gerekir.

Comparison of Conventional Methods, MALDI-TOF MS and Sequence Analysis Methods for Identification of Aspergillus Species Isolated from Clinical Samples

Objective: Fungal infections associated with Aspergillus species cause invasive diseases leading high mortality and morbidity as a result of deficiency of primary defence systems in immunosuppressive patients. Therefore, starting appropriate antifungal treatment after rapid and accurate diagnosis is critically important for invasive aspergillosis patients. Nowadays, more rapid, easily applicable, having high sensitivity and specifity new diagnostic methods are required. In this study, identification of Aspergillus spp. isolated from various clinical samples by using conventional methods, MALDI-TOF MS system and DNA sequence analysis and comparison of the methods are aimed. Methods: Totally 50 Aspergillus strains were included in this study. Two isolates were excluded from the study due to contamination. Results: 25 strains were identified as A.fumigatus species complex (52.08%), 17 strains were identified as A.flavus species complex (35.42%), 3 strains were identified as A.niger species complex (6.25%), 2 strains were A.terreus species complex (4.17%) and 1 strain was A.sydowii species complex (2.08%) byITS sequence analysis method used as reference diagnostic method in this study. The sequence analysis wasthe gold standard method and it was observed that there was 97.9% compliance compared to the conventional method. Two different software programmes were used for MALDI-TOF MS system. 37 strains (77.1%) were accurately defined by current IVD (in vitro diagnostic) VITEK MS V.2.0 whereas 42 strains (87.5%) were accurately defined by SARAMIS 4.12 RUO software programme. Conclusions: Molecular methos are thought to be appropriate to be used as complementary method when conventional methods are insufficient for identification at the species level. Although MALDI-TOF MS method is rapid and sensitive method when evaluated in terms of time, it is concluded that such studies should be repeated with more strains to develop database.

PDF

___

1. Atalay A, Koc AN, Suel A, et al. Conventional Morphology Versus PCR Sequencing, rep-PCR, and MALDI-TOF-MS for Identification of Clinical Aspergillus Isolates Collected Over a 2-Year Period in a University Hospital at Kayseri, Turkey. J Clin Lab Anal. 2016; 30: 745-50.
2. Gautier M, Normand AC, Ranque S. Previously unknown species of Aspergillus. Clin Microbiol Infect. 2016; 22: 662-9.
3. Sanguinetti M, Posteraro B. Identification of Molds by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. J Clin Microbiol. 2017; 55: 369-79.
4. Lamoth F. Aspergillus fumigatus-Related Species in Clinical Practice.Front Microbiol. 2016; 7: 683.
5. Li Y, Wang H, Zhao YP, Xu YC, Hsueh PR. Evaluation of the Bruker Biotyper Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry System for Identification of Aspergillus Species Directly from Growth on Solid Agar Media.Front Microbiol. 2017; 8: 1209.
6. Gülmez D. Aspergillus fumigatus Kompleksi: Zorlu Bir Patojende Yeni Bir Sorun, Azol Direnc. Türk Mikrobiyol Cem Derg. 2018; 48: 153-66.
7. Iǂhalupovrƴ J, Raus M, SedlrƴĔovrƴ M, Sebela M. Identification of fungal microorganisms by MALDI-TOF mass spectrometry. Biotechnol Adv. 2014; 32: 230-41.
8. Nakamura S, Sato H, Tanaka R, Yaguchi T. Verification of Ribosomal Proteins of Aspergillus fumigatus for Use as Biomarkers in MALDI-TOF MS Identification. Mass Spectrom (Tokyo). 2016; 5: A0049.
9. Pelit S, Erkoǅse Genç G, Barış A, Erturan Z. Trichosporon Tuǅrlerinin Tanımlanmasında Matriks Aracılı Lazer Dezorpsiyon Iǚyonizasyon-Uçuş Zamanlı-Kuǅtle Spektrometresi (MALDI-TOF MS) Sisteminin API ID 32Iǂ ve VITEK 2 ile Karşılaştırılması. Tuǅrk Mikrobiyol Cem Derg. 2017; 47: 169-75.
10. Özcan N, Ezin Ö, Akpolat N, Mete M, Gül K. Identification of Candida species isolated from clinical specimens by MALDI-TOF MS. Dicle Medical Journal. 2016; 43: 390-4.
11. Yılmaz S, Duyan S, Artuk Iǂ, Diktaş H. Applications of MALDI-TOF MS in Microbiological Identification. TAF Prev Med Bull. 2014; 13: 421-6.
12. Vidal-Acuña MR, Ruiz-Pérez de Pipaón M, TorresSánchez MJ, Aznar J. Identification of clinical isolates of Aspergillus, including cryptic species, by matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Med Mycol. 2018; 56: 838-46.
13. Park JH, Shin JH, Choi MJ, et all. Evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionization time-offight mass spectrometry for identification of 345 clinical isolates of Aspergillus species from 11 Korean hospitals: comparison with molecular identification. Diagn Microbiol Infect Dis. 2017; 87: 28-31.
14. Schulthess B, Ledermann R, Mouttet F, et all. Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory. J Clin Microbiol. 2014; 52: 2797-803.
15. Erdem Iǚ, DogǍan M, Karaali R, Omar E, Ardiç E. Treatment Of Invasıve Aspergıllosıs. Namık Kemal Tıp Dergisi. 2018; 6: 64-8.
16. Birinci A, Çaycı YT. Mantar Enfeksiyonlarının Serolojik Tanısı. Tuǅrk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi 2016; 73: 175-82.
17. Ullmann AJ, Aguado JM, Arikan-Akdagli S, et all. Diagnosis and management of Aspergillus diseases: executive summary of the 2017 ESCMID-ECMM-ERS guideline. Clin Microbiol Infect. 2018; 24 (Suppl1) e1- e38.
18. Sleiman S, Halliday CL, Chapman B, et al. Performance of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Aspergillus, Scedosporium, and Fusarium spp. in the Australian Clinical Setting. J Clin Microbiol. 2016; 54: 2182-6.
19. Liao Y, Chen M, Hartmann T, Yang RY, Liao WQ. Epidemiology of opportunistic invasive fungal infections in China: review of literature. Chin Med J (Engl). 2013; 126: 361-8.
20. Aslan M, oưz Y, Akşit F, Akay MO. Iǚnvaziv Fungal Enfeksiyonların Tanısında In-House Polimeraz Zincir Reaksiyonunun DegǍerlendirilmesi. Osmangazi Tıp Dergisi/Osmangazi Journal of Medicine. 2016; 38: 26-31.
21. Alshareef F, Robson GD. Prevalence, persistence, and phenotypic variation of Aspergillus fumigatus in the outdoor environment in Manchester, UK, over a 2-year period. Med Mycol. 2014; 52: 367-75.
22. Alanio A, Beretti J-L, Dauphin B, et all. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry for fast and accurate identification of clinically relevant Aspergillus species. Clin Microbiol Infect. 2011; 17: 750-5.
23. Ranque S, Normand AC, Cassagne C, et all. MALDITOF mass spectrometry identification of filamentous fungi in the clinical laboratory. Mycoses. 2014; 57: 135-40.
24. Bader O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 2013; 13: 788-99.
25. Verwer PE, van Leeuwen WB, Girard V, et all. Discrimination of Aspergillus lentulus from Aspergillus fumigatus by Raman spectroscopy and MALDI-TOF MS. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2014; 33: 245-51.