Kondroitin sülfat tayini için immünfloresan boyamalarda optimum fiksasyon yönteminin belirlenmesi

Amaç: Kondroitin sülfat (KS) zincirleri embriyonik hücre bölünmesi, sitokinez ve gelişimde rol oynayan, C. elegans’tan fareye benzer rollerde görev alan moleküllerdir. KS moleküllerinin fonksiyonları kurtçuktan memeli sistemlere kadar korunmuştur. Doku ve hücrelere mekanik destek veren, nöronal plastisite ve hücre migrasyonunda görev alan KS moleküllerinin biyosentezi, C. elegans’ta insandakine benzer bir mekanizma ile gerçekleştirilmektedir. 40 yılı aşkın geçmişi ile sağladığı kaynaklar ve ikisi Fizyoloji ve Tıp alanında, biri Kimya alanında olmak üzere C. elegans’ı kullanan bilim insanlarının aldığı Nobel ödülleri ile C. elegans model organizması insan moleküler biyolojisini anlamak için eşsiz bir platformdur. C. elegans ve insan arasında birçok biyolojik işlev korunmuştur. İnsan hastalık genlerinin % 65’ine C. elegans genomunda bir karşılık bulunabilmektedir. Bu çalışmada, C. elegans model organizmasında kondroitin sülfat moleküllerinin immünfloresan boyama tekniği ile gözlemlenmesi için en etkin fiksasyon yönteminin belirlenmesi hedeflenmiştir. Yöntem: İmmünfloresan boyamaların gerçekleştirilmesi için embriyolar, erişkin C. elegans ‘lardan izole edilmiş ve embriyo pelletleri %4 paraformaldehid (PFA) ve metanol ile fikse edilmek üzere iki farklı tüpe ayrıştırılmıştır. İnkübasyon ve yıkama aşamalarını takiben, örnekler, chondroitinase ABC (CSase ABC) enzimi ile muamele edilmiştir. Enzimin inaktive edilmesinin ardından %10 donkey serum ile bloke edilen embriyo pelletleri, primer antikor anti-chondroitin antibody (anti-proteoglycan ΔDi-0S antibody 1B5, 1:20; Seikagaku) ile gece boyu inkübe edilmiştir. Sekonder antikor olarak donkey anti-mouse Alexa 488 (Life Technologies) 1:250 oranında kullanılmış ve mikroskop preparatları hazırlanmıştır. Görüntüler inverted mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. Bulgular: PFA ile yapılan boyamalarda, embriyonik katman yapılarının daha iyi korunduğu görülmüştür. Metanol ile fiksasyonun, embriyonik tabakaların yapısını bozduğu ve kondroitin boyamalarının başarısını düşürdüğü gözlemlenmiştir. Yapılan analiz ve karşılaştırmalarda, PFA ile yapılan fiksasyon aşamasının otofloresan sinyalini artırsa da, KS sinyalinin ve morfolojik yapısının tespiti için metanol ile yapılan fiksasyon yöntemine göre daha iyi sonuç verdiği gözlemlenmiştir. Sonuç: Bu çalışmada, KS tayini için en etkin yöntemin PFA fiksasyon yöntemi olduğu tespit edilmiştir. Böylece, PFA ile fiksasyon yöntemi kullanılarak, KS moleküllerine dair C. elegans model organizmasında fenotipik değişiklikler daha nitelikli ve yüksek doğrulukta analiz edilebilecektir.

Anahtar Kelimeler:

Kondroitin sülfat, fiksasyon yöntemi, C. elegans, immünfloresan boyama, ekstraselüler matriks

PDF

___

1. Izumikawa T, Dejima K, Watamoto Y, et al. Chondroitin 4-O-Sulfotransferase Is Indispensable for Sulfation of Chondroitin and Plays an Important Role in Maintaining Normal Life Span and Oxidative Stress Responses in Nematodes. J Biol Chem. 2016;291(44):23294-23304. doi:10.1074/jbc.M116.757328
2. Mizuguchi S, Uyama T, Kitagawa H, et al. Chondroitin proteoglycans are involved in cell division of Caenorhabditis elegans. Nature. 2003;423(6938):443-448. doi:10.1038/nature01635
3. Sonnhammer EL, Durbin R. Analysis of protein domain families in Caenorhabditis elegans. Genomics. 1997;46(2):200-216. doi:10.1006/geno.1997.4989
4. Sulston JE, Horvitz HR. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 1977;56(1):110-156. doi:10.1016/0012-1606(77)90158-0
5. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 1998;282(5396):2012-2018. doi:10.1126/science.282.5396.2012
6. Duerr JS. Antibody staining in C. elegans using “freeze-cracking.” J Vis Exp. 2013;(80):50664. doi:10.3791/50664
7. Chew YL, Fan X, Götz J, Nicholas HR. PTL-1 regulates neuronal integrity and lifespan in C. elegans. J Cell Sci. 2013;126(Pt 9):2079-2091. doi:10.1242/jcs.jcs124404
8. Yücel D. Investigations into the function and regulation of the C-terminal binding protein (CTBP-1) in C. elegans. Published online 2012.
9. Kim S-O, Kim J, Okajima T, Cho N-J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 2017;4(1):5. doi:10.1186/s40580-017-0099-9
10. Matuszko G, Curreli S, Kaushik R, Becker A, Dityatev A. Extracellular matrix alterations in the ketamine model of schizophrenia. Neuroscience. 2017;350:13-22. doi:10.1016/j.neuroscience.2017.03.010
11. Suttkus A, Morawski M, Arendt T. Protective Properties of Neural Extracellular Matrix. Mol Neurobiol. 2016;53(1):73-82. doi:10.1007/s12035-014-8990-4
12. Donegan JJ, Lodge DJ. Hippocampal Perineuronal Nets Are Required for the Sustained Antidepressant Effect of Ketamine. Int J Neuropsychopharmacol. 2017;20(4):354-358. doi:10.1093/ijnp/pyw095