Dopamin taşıyıcıların kokain bağlama bölgesi ile N-ucu arasındaki uzaysal yakınlığının FRET ile belirlenmesi

Amaç: Dopamin taşıyıcılar (DAT) dopaminin sinaptik gerialımından ve böylelikle sinirsel iletinin çabuk sonlanmasından sorumludur. Bu proteinler alışkanlık yapıcı kokain, amfetamin gibi maddelerin de etki merkezlerini oluşturur. Proteinin N-ucunda bulunan Serin 7 ve 12’nin fosforilasyon bakımından kritik amino asitler olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada N-ucu ile kokain bağlama bölgesi arasındaki uzaklık, yaban tip ve Ser7/12Asp ve Ser7/12Ala mutantlarında belirlenmiştir. Gereç ve Yöntem: Sarı-floresan protein (YFP) ve mutasyonlar DAT’ın N-terminal ucuna 2-aşamalı PCR ile yerleştirilmiştir. Dopamin geri-alım testleri yapılmış ve konfokal mikroskopta verici-ağartma yöntemi ile Förster rezonans enerji transferi (FRET) mesafeleri belirlenmiştir. Bulgular: Tüm N-ucundan YFP-etiketlenmiş DAT proteinleri düzgün olarak hücre yüzeyine taşınmıştır. Km değerleri sırasıyla yaban tip, Ser7/12Ala and Ser7/12/Asp mutantları için 0.76, 0.75 ve 1.24 mM olarak saptanmıştır. FRET etkinliği yaban-tip DAT için 0.15 olarak bulunmuş ve FRET uzaklığı 68.4 Å olarak bulunmuştur. Diğer konstraktlarda FRET etkinlikleri negatiftir ve enerji transferi saptanmamıştır. Sonuç: Veriler bize N-ucu bölgesinin kokain bağlama bölgesi ile FRET mesafesinde olduğunu ve kritik serin rezidülerinin mutasyonlarının (Ser7/12Asp) bu mesafeyi arttırdığını göstermektedir

Anahtar Kelimeler:

Dopamin taşıyıcı (DAT), Kokain bağlama, Förster rezonans enerji transferi (FRET), DAT amino terminal, DAT fosforilasyonu

-

Keywords:

-,

PDF

___

1. Amara SG, Kuhar MJ. Neurotransmitter transporters: recent progress. Annu Rev Neurosci 1993; 16: 73-93. doi: 10.1146/ annurev.ne.16.030193.000445
2. Giros B, Caron MG. Molecular characterization of the dopamine transporter. Trends Pharmacol Sci 1993; 14: 43-9. doi:10.1016/0165-6147(93)90029-J
3. Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu Rev Neurosci 2006; 29: 565-98. doi: 10.1146/annurev. neuro.29.051605.113009
4. Yamashita A, Singh SK, Kawate T, et al. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl- dependent neurotransmitter transporters. Nature 2005; 437: 215-23. doi:10.1038/ nature03978.
5. Guptaroy B, Zhang M, Bowton E, et al. A juxtamembrane mutation in the N terminus of the dopamine transporter induces preference for an inward-facing conformation. Mol Pharmacol 2009; 75: 514-24. doi: 10.1124/mol.108.048744.
6. Lin Z, Zhang PW, Zhu X, et al. Phosphatidylinositol 3-kinase, protein kinase C, and MEK1/2 kinase regulation of dopamine transporters (DAT) require N-terminal DAT phosphoacceptor sites. J Biol Chem 2003; 278: 20162-170. doi : 10.1074/jbc. M209584200.
7. Khoshbouei H, Sen N, Guptaroy B, et al. N-terminal phosphorylation of the dopamine transporter is required for amphetamine-induced efflux. PLoS Biology 2004; 2: 0387- 93. doi: 10.1371/journal.pbio.0020078
8. Granas C, Ferrer J, Loland CJ, et al. N-terminal truncation of the dopamine transporter abolishes phorbol ester- and substance P receptor-stimulated phosphorylation without impairing transporter internalization. J Biol Chem 2003; 278: 4990-5000. doi : 10.1074/jbc.M205058200.
9. Förster T. Mechanism of energy transfer. In: Glorkin M and Stotz EH, editors. Vol 22. Comprehensive Biochemistry. Amsterdam:Elsevier, 1967: 61-80.
10. Eriksen J, Bjørn-Yoshimoto WE, Jørgensen TN, et al. Postendocytic sorting of constitutively internalized dopamine transporter in cell lines and dopaminergic neurons. J Biol Chem 2010; 285: 27289-301. doi :10.1074/jbc.M110.131003.
11. Indarte M, Madura JD, Surratt CK. Dopamine transporter comparative molecular modeling and binding site prediction using the LeuTAa leucine transporter as a template. Proteins 2008; 70: 1033-46. doi : 10.1002/prot.21598.
12. Shan J, Javitch JA, Shi L, et al. The substrate-driven transition to an inward-facing conformation in the functional mechanism of the dopamine transporter. PLoS One 6, e16350. doi: 10.1371/journal.pone.0016350
13. Kristensen AS, Andersen J, Jørgensen TN, et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev 2011; 63: 585-640. doi: 10.1124/ pr.108.000869.
14. Cervinski MA, Foster JD, Vaughan RA. Psychoactive substrates stimulate dopamine transporter phosphorylation and down-regulation by cocaine-sensitive and protein kinase C-dependent mechanisms. J Biol Chem 2005; 280: 40442-9. doi: 10.1074/jbc.M501969200.
15. Moritz AE, Foster JD, Gorentla BK, et al. Phosphorylation of dopamine transporter serine 7 modulates cocaine analog binding. J Biol Chem 2013; 288: 20-32. doi: 10.1074/jbc. M112.407874