Pelajik ve Bentik Balıklarının Solungaçlarından Saflaştırılan Karbonikanhidraz Aktivitelerinin İrdelenmesi
Bu çalışmada, denizel ortamda bentik bölgede yaşayan Mezgit ve pelajik bölgede yaşayan Hamsi balıklarının solungaçlarından karbonik anhidraz (CA) saflaştırıldı ve karakterize edildi. Mezgit balığı solungacından elde edilen CA enzimi, Sepharose-4B-L tirozin-sülfanilamid afinite kolonunda 14 kat ve %19,5 verimle saflaştırıldı. Hamsi balığı solungacından elde edilen CA enzimi ise 17 kat ve %9,5 verimle saflaştırıldı. Mezgit ve Hamsi balıklarının özgül aktiviteleri sırasıyla 126,4 EU mg protein-1 ve 1000,0 EU mg protein-1 olarak belirlendi. SDS-PAG Elektroforezi sonucunda her iki balığın solungaçlarından saflaştırılan karbonik anhidrazların altbirim molekül kütlesi yaklaşık 29 kDa olan tek protein bantlarına sahip oldukları belirlendi. Solungaçlarından elde edilen CA’ların p-nitrofenil asetat substratı varlığında esteraz aktiviteleri pH 8,0’da ve 40 oC sıcaklıkta en yüksek olduğu belirlendi. Mezgit ve Hamsi balıklarının solungaçlarından saflaştırılan CA’ nın, p-nitrofenol asetat substratı varlığında Km ve Vmaks değerleri Lineweaver-Burk grafiğiyle hesaplandı ve sırasıyla Km değeri 0,08 mM ve 0,01 mM, Vmaks değeri 1x107mM dak-1 ve 2,5x106mM dak-1 olarak tespit edildi. Mezgit ve Hamsi balıklarının solungaçlarından elde edilen CA’ nın sırasıyla sülfanilamid inhibitörü varlığında 6,0 µM ile 4,0 mM ve asetazolamid inhibitörü varlığında ise 2,0 µM ile 2,0 mM IC50 değerlerine sahip olduğu tespit edildi.
Anahtar Kelimeler:
Karbonikanhidraz, mezgit, hamsi, Pelajik, Bentik
Investigation of Purified Carbonic Anhydrase Activity from The Gills of Pelagic and Benthic Fish
In this study, carbonic anhydrase (CA) was purified and characterized from the gills of anchovy fish living in the pelagic region and whiting living in the benthic region in marine environment. Carbonic anhydrase from the whiting gill was purified 14 fold and %19.5 yield using Sepharose-4B-L tyrosine-sulfanilamide affinity column. Also, carbonic anhydrase from the anchovy gill was purified 17 fold and %9.5 yield using same column. The specific activity of whiting and anchovy fish were determined as 126.4 EU mg protein-1 and 1 000.0 EU mg protein-1, respectively. SDS-PAG Electrophoresis showed that the carbonic anhydrases purified from the gills of both fish had single protein bands with a subunit molecular mass of approximately 29 kDa. In the presence of p-nitrophenyl acetate substratum of gills, esterase activities were found to be highest at pH 8.0 and 40 ° C. The values of Km and Vmax of carbonic anhydrase from the gills of whiting and anchovy fish were calculated by Lineweaver-Burk graph in the presence of p-nitrophenol acetate substrate and Km values were determined as 0.08 mM and 0.01 mM respectively, Vmax value was 1x107 mM min-1 and 2.5x106mM min-1, respectively. It was determined that the CA obtained from the gills of whiting and anchovy fish had an IC50 value of 6.0 μM to 4.0 μM against the sulfanilamide inhibitor, respectively and 2.0 μM to 2.0 μM, against the acetazolamide inhibitor.
Keywords:
Carbonic anhydrase, Whiting, Anchovy, Pelagic, Benthic,
___
- Armstrong, JM., Myers, DV., Verpoorte, JA. and Edsall, JT., (1966). Purification and properties of human erythrocyte carbonic anhydrases. The Journal of Biological Chemistry, 241, 5137-5145.
- Arslan, O., Nalbantoğlu, B., Demir, N., Özdemir, H., Küfrelioğlu, Öİ., 1996. New Method for the Purification of Carbonic Anhydrase Isozymes by Affinity Chromatography. Turkish Journal of Medical Science, 26 (2), 163-166.
- Beydemir Ş., Çiftçi M., Özmen I., Okuroğlu ME., Özdemir H., Küfrevioğlu, Öİ., 2000. Effects of some medical drugs on enzyme activities of carbonic anhydrase from human erythtocytes in vitro and from rat erythtocytes in vivo. Pharmacological Research, 42, 187-19.
- Bülbül, M., Hisar, O., Beydemir, B., Çiftçi, M. and Küfrevioğlu, Öİ., 2003. The in vitro and in vivo inhibitory effects of some sulfonamide derivatives on rainbow trout erythrocyte carbonic anhydrase activity. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 18 (4), 371-375.
- Chegwidden, WR., Dodgson, SJ. and Spencer, IM., 2000. In the Carbonic Anhydrase New Horizons. Chemistry Medicinal Research Reviews, 23, 146-189.
- Dinçer, B., Ekinci, AP., Akyüz, G. and Kurtoğlu, IZ., 2016. Characterization and inhibition studies of carbonic anhydrase from gill of russian sturgeon fish (Acipenser gueldenstaedtii). Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 31 (6), 1662-1665.
- Hisar, O., Hisar, Ş., Yanık, T. ve Aras, M., 2003. Balık kan karbondioksitinin taşınması ve atılmasında karbonik anhidraz izoenzimlerinin fonksiyonları. Atatürk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi Dergisi, 34(4), 387-393.
- Karahalil, F., 2009. Mersin Balığı eritrositlerinden elde edilen karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu. Karadeniz Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. Doktora, Trabzon, Türkiye, 88s.
- Kaya, ED., 2011. Çipura (Sparus aurata) balığının karaciğer, solungaç ve böbrek dokularından karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması, karakterizsayonu ve bazı metal iyonarının enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi. Atatürk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Erzurum, Türkiye, 173s.
- Kaya, ED., Söyüt, H. and Beydemir, Ş., 2015. The toxicological impacts of some heavy metals on carbonic anhydrase from gilthead sea bream(Sparus aurata) gills. Enviromental Toxicology and Pharmacology, 39 (2), 825-832.
- Kolaylı, S., Karahalil, F., Şahin, H., Dinçer, B. and Supuran, CT., 2011. Characterization and inhibition studies of an α carbonic anhydrase from the endangered sturgeon species Acipenser gueldenstaedti. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 26 (6), 895-900.
- Laemmli, UK., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.
- Lowry, OH., Rosebrough, NJ., Farr, AL. and Randall, RJ., 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry, 193, 265-275.
- Maren, TH., 1960. A simplifield micromethod for the determination of carbonic anhydrase and its inhibitors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 130 (1), 26-29.
- Pullan, LM. and Noltmann, EA., 1985. Purification and properties of pig muscle carbonic anhydrase III. Biochimica et Biophysica Acta (BBA), 839 (2), 147-54.
- Söyüt, H., 2006. Gökkuşağı Alabalık Dokularından Karbonik Anhidraz Enziminin Saflaştırılması, Karakterizasyonu ve Kinetik Özelliklerinin İncelenmesi, Atatürk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Erzurum, Türkiye. 201s.
- Supuran, CT., 2008. Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and Activators, Nature Reviews Drug Discovery, 7, 168–181.
- Supuran, CT., 2017. Bortezomib inhibits mammalian carbonic anhudrases. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 25, 64-67.
- Supuran, CT. and Scozzafava, A., 2001. Carbonic anhydrase inhibitors, Current Medicinal Chemistry-Immunology. Endocrine & Metabolic Agents, 1, 61-97.
- Verporte, JA., Mehta, ST. and Edsall, J., 1967. Esterase activities of human carbonic anhydrases. The Journal of Biological Chemistry, 242, 4221-4229.
- Wistrand, PJ., 1981. The importance of carbonic anhydrase B and C for the unloading of CO2 by the human erythrocyte., Acta Physiologica, 113 (4), 417-426.
- Wistrand, PJ., 2002. Carbonic anhydrase III in liver and muscle of male rats purification and properties. Upsala Journal of Medical Sciences, 107 (2), 77-88.
- Yayın Aralığı: Yılda 4 Sayı
- Başlangıç: 2016
- Yayıncı: Bülent VEREP
Sayıdaki Diğer Makaleler
Benay TUNÇSOY, Ayşe KARA, Pinar ÖZALP
Barbaros DİNÇER, Pelin BİRİNCİ
Timur GÜLHAN, Merve Gizem SEZENER, Serhan AKGÖZ, Volkan ERGÜDEN, Arzu FİNDİK, Alper ÇİFTCİ