DNA İzolasyonunda fenol-kloroform yerine potasyum asetat kullanımının DNA miktarı ve kalitesi üzerine etkisi

Bu çalışmanın amacı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) işlemlerinde kullanılmak üzere kandan genomik DNA izolasyonu amacıyla fenol-kloroform yöntemi yerine potasyum asetat çözeltisi kullanımının elde edilen DNA miktarı ve kalitesi üzerine etkisini araştırmaktır. Bu amaçla Kilis keçilerinden toplanmış olan 13 adet kan örneği kullanılmıştır. Her bir örnekte proteinaz K uygulamasını ardından fenol-kloroform ile DNA izolasyonu veya potasyum asetat ile çöktürme işlemi uygulanmıştır. Elde edilen DNA çözeltilerinin konsantrasyonları ve saflığı sırasıyla 260 nm ve 260nm/280nm de spektrofortometre ile ölçülmüştür. Fenolkloroform ve potasyum asetat grubunda ortalama DNA konsantrasyonu sırasıyla 0,4185±0,2368 ve 0,2753±0,0846 bulunmuştur. Absorbans oranları ise fenol-kloroform ve potasyum asetat grubunda sırasıyla ortalama 1,6380±0,1817 ve 1,7435±0,0659 olarak tespit edilmiştir. Gruplar arasındaki fark istatistiksel açıdan önemli bulunmuştur. Sonuç olarak DNA izolasyonunda proteinleri ortamdan uzaklaştırmak amacıyla potasyum asetat kullanıldığında fenolkloroform grubuna göre daha düşük düzeyde DNA elde edilmiş olsa da yeterli miktar ve kalitede DNA elde edilebildiğinden araştırıcının sağlığı ve çevreye zararlı olan fenol yerine potasyum asetatın DNA izolasyonunda kullanılabileceği kanaatine varılmıştır.

Effect of using potassium acetate instated of phenol-chloroform for DNA isolation on DNA yield and quality

The objective of this study was to investigate the effect of using potassium acetate instead of phenol-chloroform on the yield and quality of DNA used for polymerase chain reaction (PCR) assays. For this purpose 13 blood samples collected from Kilis goats were used. After proteinase K digestion, phenol-chloroform extraction or treatment with potassium acetate was performed on aliquots of each sample. Concentration and purity of DNA samples were measured at 260 nm and 260nm/280nm by using a spectrophotometer, respectively. Concentration of DNA in phenol-chloroform and potassium acetate groups were found to be 0.4185±0.2368 and 0.2753±0.0846 respectively. Absorbance ratio values of phenol-chloroform and potassium acetate groups were 1.6380±0.1817 and 1.7435±0.0659 respectively. Differences between groups were statistically significant. The results suggested that sufficient amount of DNA were obtained by using potassium acetate in order to remove proteins. Therefore potassium acetate can be used instead of phenol-chloroform which is more hazardous for the health of researchers or for the environment, although DNA yield obtained by using potassium acetate was lower than that obtained by using phenol-chloroform.

PDF

___

Akyüz B, Bayram D, ErtuğruL O, İşcan KM, 2008: Türkiye de yetistirilen holstayn ve bazı yerli sığır ırklarında citrullinemia allelinin belirlenmesi. Erciyes Üniv Vet Fak Derg 5 (1), 17-20.
Akyüz B, ErtuğruL O, 2008: Türkiyede Holştayn ve yerli sığırlarda üridin monofosfat senteaz eksikliğinin (DUMPS) belirlenmesi. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 55, 57-60.
Anonim (2012): 260/280 and 260/230 Ratios. Thermo Scientific. Technical Bulletin. http://batzerlab.lsu.edu/genomics/document ation/3130_NanoDrop_tips.pdf (Erişim Tarihi 27.06.2012)
Bailes SM, Devers JJ, Kirby JD, Rhoads DD, 2007: An inexpensive, simple protocol for dna isolation from blood for high-throughput genotyping by polymerase chain reaction or restriction endonuclease digestion. Poultry Sci 86, 102 106.
Balcıoğlu MS, Sahin E, Karabağ K, Karslı T, Alkan S, 2010: Türkiye Yağlı Kuyruklu Koyun Irklarında DNA Parmak izinin RAPD-PCR Yöntemi Kullanılarak Saptanması Tarım Bilimleri Dergisi, 16, 55-61
Bozkaya F, Mundan D, Karabulut O, Yerturk M, Gurler S, Aral F, 2008: An investigation on the distribution of O and D alleles of the CSN1S2 gene in goat populations raised in southeastern region of Turkey. Small Rumin Re., 78, 193-196.
Bozkaya F, Gürler Ş, 2011: Diversity of a microsatellite locus in the CSN1S1 gene in goat populations raised in the southeastern region of Turkey. Afr J Biotehcnol, 16, 3087- 3090
Budak Yıldıran FA, Yıldız K, Çakır Ş, Gazyağcı AN, 2010: Kırıkkale bölgesinde koyun kökenli Echinococcus granulosus izolatlarının moleküler karakteri. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 16 (2), 245-250.
Demeke T, Jenkins GR, 2010: Influence of DNA extraction methods, PCR inhibitors and quantification methods on real-time PCR assay of biotechnology-derived traits. Anal Bioanal Chem, 396, 19771990
Hiesinger M, Löffert D, Ritt C, Oelmüller U, 2001: The effects of phenol on nucleic acid preparation and downstream applications Qiagen News, 5, 23-26
Korkmaz Ağaoğlu Ö, Çınar Kul B, Akyüz B, Özkan E, Ertuğrul O, Erol H. 2010. Keçi türünde mikrosatellit polimorfizmininbelirlenmesinde farklı çoklu-PZR (Multipleks PCR) sistemleri. Vet Hekim Der Derg, 81, 21-27
Lahiri DK, Bye S, Nurnberger JI, Hodes ME, Crisp M, 1992: A non-organic and non-enzymatic extraction method gives higher yields of genomic DNA from whole-blood samples than do nine other methods tested J Biochem Bioph Met, 25, 193205
Minitab Inc. 1998: MINITAB release 12 for Windows. Minitab Inc., State College, Pennsylvania.
Özşensoy Y, Kurar E, Bulut Z, Nizamlıoğlu M, 2008: Mikrosatellit DNA markörleri kullanılarak atlarda ebeveyn tayini: Bir vaka takdimi. Vet Bil Derg, 24, 87-91.
Richardson AJ, Narendran N, Guymer RH, Vu H, Baird PN, 2006: Blood storage at 4°C-factors involved in DNA yield and quality. J Lab Clin Med Volume 147, 290-294.
Riemann K, Adamzik M, Frauenrath S, Egensperger R, Kurt W. Schmid, Brockmeyer NH, Siffert W, 2007: Comparison of Manual and Automated Nucleic Acid Extraction From Whole-Blood Samples. J Clin Lab Anal, 21, 244248
Ramunno L, Cosenza G, Pappalardo M, Pastore N, Gallo D, Digregorio P, Masina P, 2000: Identification of the goat CSN1S1F allele by means of PCR-RFLP method. Anim Genet 31, 342-343
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, 1989: Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Wilfinger WW, Mackey K, Chomczynski P, 1997: Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques, 22, 474-481