Sevil ERDENLİĞ GÜRBİLEK, Osman YAŞAR TEL, Oktay KESKİN

Brusellozis Şüpheli Sürülerdeki İneklerden Alınan Klinik Örneklerden Brucella spp Tanısı İçin PCR ve Bakteriyolojik Kültür Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Bu çalışmada, Şanlıurfa İlinde brusella infeksiyonu olduğu düşünülen sürülerdeki ineklerden alınan 68 adet kan (akyuvar kısmı), serum, süt ve vajinal sıvap örneklerinden Brucella etkenlerinin tanısı için bakteriyolojik kültür ve PZR yöntemlerinin karşılaştırılması hedeflendi. Serum örneklerinin Rose Bengal Pleyt Test (RBPT) antijeni ile aglütinasyon testinde 35 örnek (% 51,4) ve süt örneklerinin Süt Ring Testi (SRT) ile analizinde ise 39 süt örneği pozitif bulundu (% 57,4). Süt örneklerinden 15 (% 22) adet Brucella spp. izolasyonu gerçekleşti. Tüm izolatlar B. abortus biyotip 3 olarak identifiye edildi. Akyuvar kısmından ve vaginal sıvaplardan Brucella spp. izolasyonu yapılamadı. Klinik örneklerin tümünün DNA ekstraksiyonlarının ardından yapılan cins spesifik PZR sonucu, süt örneklerinin 11'inden (% 16,2) ve akyuvar örneklerinin 6'sından (% 8,8) 223 bp'lik DNA amplifikasyonu saptanırken, vaginal sıvapların hiçbirinden DNA amplifikasyonu gerçekleştirilemedi. Serolojik olarak negatif inekler kültürel ve moleküler yönden negatif bulundu. İzole edilen Brucella kültürlerine yapılan Bruce ladder multipleks PZR sonucu 15 izolatın tümü B.abortus profili gösterdi. Bakteriyel kültür altın standart olarak alınarak, süt örneği için PZR duyarlılığı % 78,9 ve özgüllüğü % 100 olarak belirlendi. Sonuç olarak, kan ve vaginal sıvaplardan bakteriyel izolasyonun yapılamaması ve PZR duyarlılığının bu örneklerde düşük olmasının nedeninin, hastalığın doğası gereği etkenin aralıklı olarak süt ve vajinal akıntılar ile atılmasına ve kanda bakteri yükünün hastalığın evrelerine göre değişebilmesine bağlı olduğu düşünülmüştür. Bu nedenle gerek kültür ve gerekse DNA amplifikasyonu için kan, süt ve vajinal sıvap örneklerinin etkeni atık materyallere göre daha az taşıyabileceğinin akılda tutulmasının ve hastalığın kesin tanısı için bakteriyel serolojik ve moleküler tanı yöntemlerinin kombine olarak kullanılmasının önemli olduğu sonucuna varılmıştır

Comparisonof PCRand Bacteriological Culture t o DiagnoseBrucellaSpecies in Clinical SamplesCollected from Cows i n Brucellosis Suspected Herds

In this study, we compared PCR and bacteriological culture methods to detect Brucella species in milk, blood (buffy coat) and vaginal swabs collected from cows in suspected herds in Şanlıurfa Province. Of 68 sera and milk samples tested, 35 sera (51.4%) and 39 milk samples (57.4%) were positive by Rose Bengal Plate Test (RBPT) and Milk Ring Test (MRT), respectively. A total of 15 (22%) Brucella spp. were isolated from the milk samples. All the isolates were identified as B. abortus biotype 3. We failed to isolate Brucella spp. from both buffy coat portion of blood samples and vaginal swabs. After DNA extractions from the clinical samples, a genus specific PCR was used to detect DNA in milk, buffy coats and vaginal swabs. PCR products with a molecular size of 223 bp were obtained from 11 milk (16.2%) and 6 buffy coats (8.8%) samples. No amplification could be made from vaginal swabs. Neither bacterial isolation nor DNA amplification was ever detected from serologically negative animals. All isolates were revealed B.abortus by Bruce ladder multiplex PCR. Compared with culture, sensitivity and specificity of milk PCR were determined as 78.9% and 100%, respectively. According to the results, we thought that low sensitivity of cultural isolation and PCR in blood, milk and vaginal swabs materials could be due to intermittent shedding of the agent through milk and vaginal secretions and variation of bacterial load in the blood according to the stages of infection. Therefore, it was concluded that combination of bacteriological, serological and molecular methods could be very useful for definitive diagnosis of the disease, especially in samples with low bacterial load

PDF

___

Alton GG, Jones LM, Angus RD, Verger JM, 1988: Bacteriological methods. In: "Techniques the Brucellosis Laboratory", INRA, France.
Anonim, 2012: Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Gıda ve Kontrol Genel Müdürlüğü Brusellanın Konjuktival Aşı ile Kontrol ve Eradikasyonu Projesi.http://www.tarim.gov.tr/Documents/Mevz uat/Genelgeler/BRUCELLA.pdf, Erişim 26.03.2015. tarihi:
Baily GG, Krahn JB, Drasar BS, Stoker NG, 1992: Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification. J Trop Med Hyg, 95, 271-275.
Bricker BJ, Halling SM, 1994:Differentiation of Brucella abortus bv. 1,2, and 4, Brucella melitensis, Brucella ovis and Brucella suis bv. 1 by PCR. J Clin Microbiol, 32(11), 2660-2666.
Corbel MJ, 1989: Microbiology of the genus Brucella. In "Brucellosis: Clinical and Laboratory Aspects"Ed;. Young EJ, Corbel MJ, editor.1st ed. CRC Press, BocaRaton, FL, USA.
Erdenlig S, Iyisan AS, Baklan EA, Aksoy HY, 2007: Biovar distrubution of Brucella isolates from livestock in Turkey, 1999 to 2006. In: Proceedings of the 15 th International Federation for Health and Production of Ruminants. FEMESPRUM, Kuşadası, Turkey, pp.27- 28. of Mediterrenean
Garcia-Yoldi D, Marin CM, De Miguel MJ, Munoz PM, Vizmanos JL, Lopez-Goni I,2006: Multiplex PCR assay for the identification and differentiation of all Brucella species and the vaccine strains Brucella abortus S19 and RB51 and Brucella melitensis Rev1. Clin Chem, 52, 779-781.
Güler L, Gündüz K, Ok U, 2003: Comparison of polymerase chain reaction and bacteriological culture for the diagnosis of sheep brucellosis using aborted fetus samples. Vet Microbiol, 93,53-61.
Ica T, Aydın F, Erdenliğ S, Güler L, Büyükçangaz E, 2008: Characterisation of Brucella abortus biovar 3 isolates from Turkey as biovar 3b. The Veterinary Record, 29, 660-662.
İlhan Z, Aksakal A, Ekin IH, Gulhan T, Solmaz H, Erdenlig S, 2008: Comparison of culture and PCR for the detection of Brucella melitensis in blood and lymphoid tissues of serologically positive and negative slaughtered sheep. Lett in Appl. Microbiol, 46(3), 301-306.
Mayer-Scholl A, Draeger A, Göllner C, Scholz HC, Nöckler K, 2010: Advancement of a multiplex PCR for the differentiation of all currently described Brucella species. J Microbiol Methods ,80,112-114.
Scholz HC, Hubalek Z, Sedlacek I, Vergnaud G, Tomaso H, Al Dahouk S, Melzer F, Kampfer P, Neubauer H, Cloeckaert A et al., 2008: Brucella microti sp. nov., isolated from the commonvole Microtus arvalis. Int J Syst Evol Microbiol, 58 (2), 375-382.
Office International des Epizooties 2012: Bovine Brucellosis Chapter 2.4.3. In "Manuel of the Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals". 7th ed. OIE, Paris, France.
Romero C, Lopez-Goni I, 1999: Improved method for purification of bacterial DNA from bovine milk for detection of Brucella spp. by PCR. Appl Environ Microbiol, 65, 3735-3737.
Şahin M, Genç O, Ünver A, Otlu S, 2008:Investigation of bovine brucellosis in the Northeastern Turkey. Trop Anim Health Product, 40,281-286.