Hemoglobin D- Los Angeles [ 121(GH4) Glu>Gln] mutasyonunun yüzey plazmon rezonans (SPR) spektroskopisi ile ayırıcı molekülsel tanısı

Amaç: Bu çalışmada, Hb D-Los Angeles anormal hemoglobin (Hb) türünün laboratuar tanısında kullanılan molekülsel yaklaşımlar irdelenerek, bu hemoglobin türünün gen düzeyinde hızlı ve güvenilir tanısında, biyosensör tabanlı yüzey plazmon rezonans (SPR: Surface Plasmon Resonance) spektroskopisi kullanılabilirliğinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada, aralarında akrabalık ilişkisi olmayan, sağlıklı (Hb AA, n:5) ve heterozigot Hb D- Los Angeles [ 121(GH4) Glu>Gln] (n:5)'lı bireyler incelenmiştir. Hb D- Los Angeles mutasyonunun protein düzeyinde tanımlanmasında, alkali/asit hemoglobin elektroforezleri, DE-52 mikrokolon kromatografisi yöntemleri kullanılmıştır. Mutasyonun gen düzeyinde saptanmasında ise, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR: Polymerase Chain Reaction) tabanına dayalı Eco RI restriksiyon enzimi/ tek nükleotit polimorfizmi (SNP: Single Nucleotide Polymorphism) ve flüoresan işaretli DNA dizi analiz yöntemleri kullanılmıştır. SPR spektroskopisi kullanılarak, Hb AA ve Hb AD- Los Angeles olgulara ait biyotinli primerler ile işaretlenmiş PCR ürünleri ile mutasyon odağına özgü Eco RI restriksiyon enzim etkileşimi gerçek zamanlı olarak incelenmiştir. Bulgular: SPR spektroskopisi ile Hb AD-Los Angeles ve Hb AA olguları arasındaki farklılıklar gerçek zamanlı olarak belirlenmiştir. Elde edilen verilere göre, SPR spektroskopisi yöntemi, HbAA ve Hb ADLos Angeles mutasyonu arasındaki değişiklikleri algılayabilmektedir. Bağlanma eğrilerinden, Hb AA PCR ürünü ile Eco RI restriksiyon enzimi etkileşimi sonucu 400 arc saniyelik, heterozigot Hb AD -Los Angeles olgusunda ise, EcoRI enzimi ve hedef PCR ürünleri arasında 300 arc saniyelik rezonans kayıtları alınmıştır. Aradaki 100 arc saniyelik rezonans fark, Hb D- Los Angeles mutasyonundan kaynaklanmaktadır. Sonuç: Molekülsel tanı yöntemlerinde anormal hemoglobin bozukluklarının doğru biçimde tanımlanması önemlidir. Molekülsel tanı yöntemlerinde anormal hemoglobin bozukluklarının doğru biçimde tanımlanması önemlidir. Bu yöntemlerden protein ve gen düzeyindeki tanı yöntemlerinde, birçok hemoglobin türü benzer davranış sergilediklerinden kesin tanı yöntemi DNA dizi analizidir. DNA dizi analizi ise pahalı bir yöntem olması, analizin uzun zaman alması ve deneyimli kullanıcı gereksinimi nedeni ile her laboratuarda rutin biçimde kullanılamamaktadır.Bu doğrultuda, SPR spektroskopisi yönteminin geliştirilerek, Hb D- Los Angeles ya da benzeri anormal hemoglobin bozukluklarının kısa sürede ve gerçek zamanlı tanısında, rutin uygulamalarda kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

Differential molecular diagnostic of the hemoglobin D- Los Angeles [ 121(GH4) Glu>Gln] mutation with surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy

Objective: In this study, we aimed to determine the molecular approaches used in the laboratory diagnosis of Hb D- Los Angeles and to show rapid and reliable diagnosis of the mutation by SPR (Surface Plasmon Resonance) spectroscopy based biosensor. Materials and Methods: In this study, we were investigated with heterozygote Hb D- Los Angeles [ 121(GH4) Glu>Gln] (n:5) and healthy (Hb AA, n:5) individuals. These individuals were unrelated with each other. For the determination of the Hb D- Los Angeles mutation alkaline/acid electrophoresis DE-52 microcolumn chromatography procedures were applied at the protein level. This mutation were determinated by Eco RI restriction enzyme/SNP (Single Nucleotide Polymorphism) and labelled fluorescence automated DNA sequencing methods based on PCR (Polymerase Chain Reaction) at the gene level. We were examined by using SPR spectroscopy as real-time interactions in between biotinylated PCR products and the restriction enzyme Eco RI. Results: Differences between Hb AD-Los Angeles and Hb AA samples were determined with SPR spectroscopy as the real-time. According to our results, SPR spectroscopy method can detect the changes in between Hb AA and Hb AD Los Angeles mutation. The resonance recordings have been given 400 arc second as a result of interaction HbAA PCR products with Eco RI restriction endonuclease, whereas between Eco RI enzyme and target PCR products have been given 300 arc second in the case of heterozygous Hb D Los Angeles from the binding curves. In between them, 100 arc second of the resonance difference were caused by Hb D- Los Angeles mutation. Conclusion: Molecular diagnostic methods are important tools for the identification of the abnormal hemoglobins. Since abnormal hemoglobins present some similar results with electrophoretic and chromatographic methods, precise identification method is DNA sequencing analysis. DNA sequence analysis is not used to every laboratory routinely, because of the need for an experienced user, to give long term results and to be expensive. In this regard, we have been concluded that SPR spectroscopy can be used as routine applications in short period of time and real-time detection in the model of Hb D Los Angeles. Similar approaches based on SPR can be also developed for the abnormal hemoglobins.

PDF

___

1. Lukens J.N. The abnormal hemoglobins: General principles. In: Lee GR, Foerster J, Lukens J, Proskev F, Greer J, Rodgers GM. Eds.Wintrobe's Clinical Hematology, 10th ed., Eyg: Mass Publishing Co. 1999; 1329-1343.
2. Husiman T.H.J., Carver M.F.H., Efremov G.D. A syllabus of human hemoglobin variants. The Sickle cell anemia foundation in Agusta, 1996; GA, USA.
3. Globin gene server. http://globin.cse.psu.edu.
4. Altay Ç. Abnormal hemoglobins in Turkey. Turk. J. Heamatol. 2002; 19(1): 63-74.
5. Akar E, Akar N. A review of abnormal hemoglobins in Turkey. Turk. J. Hematol. 2007; 24(4): 143-145.
6. Atalay E.Ö., Koyuncu H., Turgut B., Atalay A., Yıldız S., Bahadır A., Köseler A. High incidence of Hb D- Los Angeles [β121(GH4) Glu>Gln] in Denizli province. Hemoglobin. 2005; 29(4): 307-310.
7. Koseler A., Koyuncu H., Ozturk O., Bahadır A., Demirtepe S., Atalay A., Atalay E.Ö., First observation of Hb Tunis [β124(H2) Pro>Ser] in Turkey. Turk. J. Hematol. 2010; 27(1): 120-122.
8. Koseler A., Bahadır A., Koyuncu H., Atalay A., Atalay E.Ö., First observation of Hb D- Ouled Rabah [β19 (B1) Asn>Lys] in Turkish population. Turk. J. Hematol. 2008; 25(1):51-53.
9. Koseler A., Atalay A., Koyuncu H., Turgut B., Bahadır A., Atalay E.Ö., Molecular identification of a rare hemoglobin variant, Hb J- Iran [β77(EF1) His>Asp]. Turk. J. Hematol. 2008; 25(1):51-53.
10. Atalay E.Ö., Atalay A., Koyuncu H., Ozturk O., Koseler A., Özkan Bahadır A., Demirtepe S. Rare hemoglobin variant Hb Yaizu observed in Turkey. Med. Princ. Pract. 2008; 17(4): 321- 324.
11. Atalay A., Koyuncu H., Koseler A., Özkan Bahadır A., Atalay E.Ö. Hb Beograd [β121(GH4) Glu>Val] in Turkish population. Hemoglobin. 2007; 31(4): 491-493.
12.Zeng Y.T., Huang S.Z., Ren Z.R., Li H.J. Identification of Hb D- Punjab gene: application of DNA amplification in the study of abnormal hemoglobins. Am. J. Hum. Genet. 1989; 44(6): 886-889.
13.Schneider R.G., Ueda S., Alperin J.B., Levin W.C., Jones R.T. Hemoglobin D Los Angeles in two Caucasian families: Hemoglobin SD disease and hemoglobin D thalassemia. Blood. 1968; 32(2):250-259.
14. Perea F.J., Casas-Castaneda M., Villalobos-arámbula A.R., Barajas H., Alveraz F., Camacho A., Hermosillo R.M., Ibarra B. Hb D-Los Angeles associated with Hb S or β-thalassemia in four Mexican Mestizo families.Hemoglobin. 1999; 23(3):231-237.
15. Hartwell S.K., Srisawang B., Kongtawelert P., Christian D., Grudpan K. Review on screening and analysis techniques for hemoglobin variants and thalassemia. Talanta. 2005; 65(5): 1149-1161.
16. Bahadır A., Köseler A., Atalay A., Koyuncu H., Akar E., Akar N., Atalay E.Ö., Hb D- Los Angeles [β121(GH4) Glu>Gln] and Hb Beograd [β121(GH4) Glu>Val]: Implications for their laboratory diagnosis and genetic origins. Turk. J. Hematol. 2009; 26(2): 17-20.
17. Mc Donnell J.Surface plasmon resonance : towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognation. Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (5): 572-577,2001.
18. IAsys Plus Technical Resources. Thermo Lab systems. Part Number: LAS860001 Issue 3. 37-40.
19. Feriotto G., Breveglieri G., Finotti A., Gardenghi S., Gambari R. Real-time multiplex analysis of four beta thalassemia mutations employing surface plasmon resonance and biosensor technology. Lab. Inves. 2004; 84: 796-803.
20. Feriotto G., Breveglieri G., Finotti A., Gardenghi S., Gambari R. Surface plasmon resonance and biosensor technology for real time molecular diagnosis of betao 39 thalassemia mutation. Mol. Diagn. 2004; 8(1): 33-41.
21.Atalay E.Ö., Ustel E., Yıldız S., Atalay A. Surface plasmon resonance based molecular detection of Hb S [β6(A3) Glu>Val, GAA>GTG] at the gene level. Hemoglobin. 2006; 30(3): 385-391.
22. Poncz M., Solowiejczyk D., Harpel B., Mory Y., Schwartz E., Surrey S., Construction of human gene libraries from small amounts of pheripheral blood: analysis of β-like globin genes. Hemoglobin. 1982; 6(1): 27-36.
23. Efremov G.D., Quantification of hemoglobins by microchromatography. In: Huisman THJ, ed. The hemoglobinopathies. Edinburgh: Churchill Livingstone. 1986; 72-90.
24.Leblond Francillard M., Dreyfus M., Rougeon F. Isolation of DNA-protein complexes based on streptavidin and biotin interaction. Eur. J. Biochem. 1987; 166 (2):351-355.