Nejdet KANDEMİR, Özlem Ates SÖNMEZOĞLU, Tuğba GÜLEÇ, Ahmet YILDIRIM

Buğdayda polimeraz zincir reaksiyonu ve olası sorunların optimizasyonu

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) DNA polimeraz enzimi aracılığıyla suni sartlarda DNA’nın çoğaltılması islemidir. Yaygın ve genis bir kullanım alanı olan PCR, moleküler çalısmalara büyük bir hız ve kesinlik kazandırmıstır. Oldukça kompleks olan bu teknik optimize edilerek basarılı bir sekilde kullanıldığında arastırmacıların isini kolaylastırmaktadır. Ancak zayıf, istenmeyen ve spesifik olmayan ürün olusumundan kaçınmak için kullanıcı gereken optimum konsantrasyon ve sartları kendisi ayarlamalıdır. Bu çalısma, PCR’de kullanılan temel bilesenlerden DNA, MgCl2, dNTP ve primer konsantrasyonlarının optimize edilmesi ve karsılasılan sorunların ortaya konulması amacıyla yapılmıstır. Bu bilesenler PCR sonucunu etkileyen kritik faktörlerdir. Diğer bilesenler sabit tutularak her bir bilesen için farklı konsantrasyonlar denenmis ve doğru amplifikasyon için gerekli optimum konsantrasyonların DNA (100 ng), MgCl2, dNTP ve primer için sırasıyla 1 μl, 2-2.25 mM, 200-400 μM ve 0.25 μM olduğu saptanmıstır. Ayrıca reaksiyon karısımına mineral yağ koymanın PCR ürününe etkisinin bulunmadığı da tespit edilmistir.

Polymerase chain reaction in wheat and optimization of the possible problems

Polymerase Chain Reaction (PCR) is a process of DNA amplification via DNA polymerase enzyme under artificial conditions in a thermal cycler. PCR, which has very common use in a wide range of different diciplines, has provided high speed and certainty for molecular studies. If this complex technique is used effectively after optimization, it makes studies easy for researchers. However, researcher should optimize the PCR conditions before any specific study to avoid from poor and nonspecific PCR products. The aim of this work was to put forward the problems encountered in a PCR and show how to optimize concentrations of DNA, MgCl2, dNTPs and primers. These are the critical components for a successful PCR process. By keeping other factors stable, it was determined that optimum DNA (100 ng), MgCl2, dNTPs and primer amounts were 1 μl, 2-2.25 mM, 200-400 μM and 0.25 μM, respectively. In addition, mineral oil addition to the mix had no effects on PCR product.

PDF

___

Akar, N., 1999. Polimeraz Zincir Reaksiyonu. Pediatrik Moleküler Patoloji ve Genetik.http://www.medicine.ankara. edu.tr/internalmedical/pediatrics/molgen/ index.
Anonim, 2004. Polymerase Chain Reaction(PCR). http://www.karymullis.com/pcr.
Anonim, 2005. PCR Generalities. Standard PCR Reaction Mix. http://www.info.med.yale.edu/genetics.
Bock, R., 1997. Biolistic Transformation of plants with anion-exchange-purified plasmid DNA. Qiagen News. Issue No:5. Institut für Biologie III, Universitat Freiburg, Germany.
Eckert, K.A. and Kunkel, T.A., 1990. High fidelity DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 18: 3739-3744.
Ellsworth, D.L., 1993. Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns. BioTechniques, 14: 214-217.
Henegariu, O., Heerema, N.A., Dlouhy, S.R., Vance, G.H. and Vogt, P.H., 1997. Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol. BioTechniques, 23: 504-511.
Karcicio, M., 2007. Uygulamalı Gen Amplifikasyonu: PCR Teknolojisi. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR). Bio 954.http://yunus.hacettepe.edu.tr/~coner.
Maxam, A., and Gibert, W., 1977. A new method Sequencing DNA. Proceeding of the National Acedemy of Sciences, 74: 560-564.
Promega, 2004. General Considerations for PCR Optimization. Protocols and Applications. Chapter 1: Nucleic Acid Amplification.
Qiagen, 2005. Critical Factors for Successful PCR. Primer Annealing and PCR buffers. http://www.qiagen.com.
Roberts, R.J., 1987. Restriction and Modification Enzymes and Their Recognition Sequences. Gene Amplif Anal, 5: 1-49.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R., 1977. DNA Sequencing with Chain-Terminating Đnhibitors. Proceeding of the National Academy of Sciences, 7: 5463-5467.
Somers, D.J., Isaac, P., Edwards, K., 2004. A high-density microsatellite consensus map for bread wheat (Triticum aestivum L.). Theor Appl Genet., 109: 1105-1114.
Southern, E.M., 1975. Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated by Gel Electrophoresis. Journal Molecular Biology, 98: 503- 517.
Watson, D.J., Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M., 1992. Recombinant DNA. Scientific American Books, s:63- 75, New York.
Weining, S. and Langridge, P., 1991. Identification and Mapping of Polymorphism in Cereals Based on the Polymerase Chain Reaction. Theor. Appl. Genet., 82: 209-216.
Williams, J.F., 1989. Optimization Strategies for the Polymerase Chain Reaction. Biotechniques, 7: 762-769