Effect of culture medium volume on the development and viability of microinjeted or noninjeted one-cell hybrid and CD-1 Strain mouse embryos

Bu çalışmada fare zigotlarının kültürlerinin yapıldığı vasat damlası hacminin, embriyoların tam olarak zonalarını terk ettikleri safhaya dek gelişimleri üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla üç deney gurubu oluşturulmuştur, ilk gurupta, 5, 10, 20, 40 ve 50 ul vasat damlaları içinde 10'ar hibrid fare zigotunun kültürü yapılmıştır, ikinci gurupta ise farklı olarak, mikroenjeksiyon işlemi geçirmiş olan hibrid fare zigotları kullanılmıştır. Son gurupta ise, CD-1 ırkı fare zigotlarının kültürü yapılmıştır. İlk gurubun gelişim değerleri arasında herhangi bir istatistiksel farka rastlanmamıştır. Tersine, ikinci ve üçüncü deney gurupları içinde istatistiksel olarak önemli farklılıklar olduğu görülmüştür. Ek olarak, her bir deney gurubuna ait blastosist safhasına erişen embriyoların hücre sayıları da saptanmış ve bulguların istatistiksel değerlendirmeleri yapılmıştır. Sonuç olarak, normal hibrid fare embriyoları için gelişimsel oran açısından en yüksek değer 5 ul hacmindeki kültür damlasında gözlenirken; en yüksek hücre sayısı ise 40 ul hacmindeki damlada elde edilmiştir. Mikroenjeksiyon geçirmiş hibrid fare zigotları için ise hem gelişim oranları hem de blastosist safhasındaki hücre sayıları açısından en yüksek değerler 40 ul hacmindeki kültür damlaları içinde elde edilmiştir. CD-1 ırkında ise en yüksek hücre sayısına 10 ul hacmindeki kültür vasatı damlasında ulaşılmıştır. Sonuç olarak, implantasyon öncesi safhalardaki fare embriyolarının in vitro gelişimleri üzerinde kültür vasatı hacminin önemli etkilere sahip bir faktör olduğu açıkça görülmüştür. Ek olarak, kültüre alınan embriyoların ait olduğu ırkların genetik yapıları ve pronükleer DNA mikroenjeksiyon gibi manipulasyonların da embriyoların in vitro gelişimsel potansiyellerini etkilediği düşünülmektedir.

Farelerde kültür vasat hacminin, mikroenjeksiyon geçirmiş ve geçirmemiş tek hücreli hibrid embriyolar ile CD-1 ırkı embriyoların gelişimleri ve canlılıkları üzerine etkileri

We investigated the effects of drop volume on the development of mouse presumptive zygotes to the completely hatched blastocyst stage. For this aim, we established 3 experimental groups. In the first group, we cultured hybrid presumptive zygotes to the hatched blastocyst stage in 10 presumptive zygotes per 5, 10, 20, 40 and 50 ul drops. In the second group, we used 'microinjected hybrid zygotes for culture. In the last group, we cultured CD-I mouse presumptive zygotes to the hatched blastocyst stage. There was no statistical difference in the first group. In contrast, the data demonstrated that there were significant differences in the second and third groups. We also determined the cell number of blastocyst stage embryos in each group and evaluated the results statistically. In conclusion, although the development rate of hybrid mouse zygotes to the hatched blastocyst stage was the highest in 5 ul culture drops, the highest blastocyst cell number was achieved in 40 ul. The highest rates for the development to the hatched blastocyst stage and the blastocyst cell number were also obtained in 40 ul culture drops for microinjected hybrid zygotes. In the CD-I strain, the highest cell number was obtained in 10 ul. It is clear from the present study that it is important to consider the culture medium volume as a crucial factor affecting the in vitro development of pre-implantation embryos. The genetic background and the manipulation process such as pronuclear microinjection of the zygotes could influence their in vitro developmental potential in terms of medium volume.

PDF

___

1. Quinn, P., Harlow, GM.: The effect of oxygen on the development of preimplantation mouse embryos in vitro. J. Exp. Zool. 1978; 206: 73-80.
2. Umaoka, Y., Noda, Y., Narimoto, K., Mori, T.: Effects of oxygen toxicity on early development of mouse embryos. Mol. Reprod. Dev. 1992:31:28-33.
3. Lane, M., Gardner, D.K.: Effect of incubation volume and embryo density on the development and viability of mouse embryos in vitro. Hum. Reprod. 1992; 7: 558-562.
4. Gardner, D.K., Lane, M.W., Lane, M.: Development of the inner cell mass in mouse blastocysts is stimulated by reducing the embryo:incubation volume ratio. Hum. Reprod. 1997; 12: 182- 183.
5. Wiley, L.M., Yamami, S., Van Muyden, D.: Effect of potassium concentration, type of protein supplement, and embryo density on mouse preimplantation development in vitro. Fertil. Steril. 1986; 45: 111-119.
6. Paria, B.C., Dey, S.K.: Preimplantation embryo development in vitro: Cooperative interactions among embryos and role of growth factors. Proc. Natl. Acad. Sci. 1990; 87: 4756-4760.
7. O'Neill, C: Autocrine mediators are required to act on the embryo by the 2-cell stage to promote normal development and survival of mouse preimplantation embryos in vitro. Hum. Reprod. 1998; 13: 1303-1309.
8. Brison, D.R., Schultz, R.M.: Apoptosis during mouse blastocyst formation: evidence for a role for survival factors including transforming growth factor alpha. Biol. Reprpd. 1997; 56: 1088-1096. 9. Dinnyes, A., Wallace, G.A,, Rail, W.F.: Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 1995; 40; 429-435.
10. Whitten, W.K., Biggers, J.D.: Complete development in vitro of the preimplantation stages of the mouse in a simple chemically defined medium. J. Reprod. Fert. 1968; 17: 399-401.
11. Bagis, H, Keskintepe L, Odaman, H, Sagirkaya, H: Effect of CZB medium on the two cell block of pre-implantation mouse embryos. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 2001; 25: 725-729.
12. Bagis, H, Odaman, H, Sagirkaya, Turgut G, Dinnyes, A: Effect of the genetic background on in vitro development of mouse embryos in potassium simplex optimized medium supplemented with amino acids (KS0Maa). Turk. J. Vet. Anim. Sci. 2003; 27: 409-415.
13. Bagis, H., Papuccuoğlu, S.: Studies on the production of transgenic mice. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 1997; 21: 287-292.
14. Bagis H, Odaman H, Sagirkaya H, Dinnyes, A.: Production of transgenic mice from vitrified pronuclear-stage embryos. Mol. Reprod. Dev. 2002; 61: 173-179.
15. Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., Lacy, E.: Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994; pp. 494
16. Canseco, R.S., Sparks, A.E.T., Pearson, R.E., Gwazdauskas, F.C.: Embryo density and medium volume effects on early murine embryo development. J. Assis. Reprod. Genet. 1992; 9: 454-457.
17. Biggers, J.D., McGinnis, L.K.: Evidence that glucose is not always an inhibitor of mouse preimplantation development in vitro. Human Reprod. 2001; 16: 153-163.
18. Bagis, H., Keskintepe, L.: Application of green fluorescent protein as a marker for selection of transgenic mouse embryos before implantation. Turk. J. Biol. 2001; 25: 123-131.
19. Ebert, K., Hammer, R.E., Papaioannou, V.E.: A simple method of counting nuclei in the preimplantation mouse embryo Experientia, 1985; 41: 1207-1209.
20. Vajta, G., Peura, T.T., Holm, P., Paldi, A., Greve, T., Trounson, A.O., Callesen, H.: A new method for culture of zona-included or zona-free embryos: the Well of the Well (WOW) system. Mol. Reprod. Dev. 2000; 55: 256-264.
21. Donnay, I., Van Langendonckt, A., Auquier, P., Grisart, B., Vansteenbrugge, A., Massip, A., Dessy, F.: Effects of co-culture and embryo number on the in vitro development of bovine embryos. Theriogenology, 1997; 47: 1549-1561.
22. Palma, G.A., Brem, G.: Effect of growth factors IGFI, TGF-a, EGF and GDGF oh development of in vitro produced bovine blastocyst. Theriogenology, 1995; 43: 291.
23. Walker, S.K., Hartwich, K.M., Robinson, J.S., Seamark, R.F.: Influence of in vitro culture of embryos on the normality of development. Gametes: Development and Function. Lauria, A., Gandolfi, F., Enne, G., Gianarolli, L., eds. Serono Symposia, Rome, 1998:457-484.
24. Rappolee, D.A., Brenner C.A., Schultz, R., Mark D., Werb, Z.: Development expression of PDGF, TGF|3a, and TGFp genes in preimplantation mouse embryos. Science, 1988; 241: 1823-1825.
25. Gandolfi, F., Moor, R.M.: Stimulation of early embryonic development in the sheep by co-culture with oviduct epithelial cells. J. Reprod. Fertil. 1987; 81: 23-28.
26. Gandolfi, F.: Autocrine, paracrine and environmental factors influencing embryonic development from zygote to blastocyst. Theriogenology, 1994; 41: 95-100.
27. Johnson, M.H., Nasr-Esfahani, M.H.: Radical solutions and cultural problems: could free oxygen radicals be responsible for the impaired development of preimplantation mammalian embryos in vitro. BioEssays. 1994; 16: 31-38.