Melanoma hücrelerinin Sendai viral vektörleri ile verimli transdüksüyonu
Amaç: Yaşayan hücrelere gen salımı yapmak üzere pek çok viral vektör geliştirilmiştir. Sendai viral SeV vektörleri geçici gen ifadesi, geniş konak özgüllüğü, düşük patojenite ve yüksek immünojenite gibi özellikleri sayesinde gen aktarımı için önemli vektörlerdir. SeV vektörleri gen tedavisi, aşı teknolojileri ve rejeneratif amaçlı moleküler tıpta sıklıkla kullanılır.Yöntem: Bu çalışmada, farklı melanoma hücre dizilerinde SeV vektörlerinin gen aktarım verimlilikleri floresan mikroskop ve konfokal lazer taramalı mikroskop görüntüleme teknikleri ile değerlendirilmiştir. A375, MDA- MB- 435, G361 ve WM115 hücreleri yeşil flüoresan proteini GFP ifade eden SeV vektörleri tarafından farklı virüs derişimlerinde enfeksiyon çarpanı MOI : 1, 3 ve 9 transdükte edilmiştir. GFP ifadesi virüs inkübasyonundan 24 ve 48 saat sonrasında kontrol edilmiştir. Konfokal lazer taramalı mikroskop görüntüleme ile gen salım verimliliği hesaplanmıştır. Bulgular: Floresan mikroskop görüntüleme ile düşük virüs derişimlerinde dahi enfeksiyon çarpanı: 1 , A375, MDA -MB- 435, G361 ve WM115 hücrelerinin SeV tarafından verimli şekilde transdükte edildiği gösterilmiştir. Viral transdüksiyonu takiben, GFP kontrol gen aktivitesi 24 saat içerisinde gözlemlenmeye başlanmış ve 48 saatte artış göstermiştir. Transdüksiyondan 24 saat sonrasında hücrelerde hafif toksisite gözlemlenmiş olsa da 48 saat sonrasında hücreler toksisite etkisinden kurtularak çoğalmış ve verimli şekilde gen ifadesi göstermişlerdir. Konfokal lazer taramalı mikroskop görüntüleme sonucuna göre 48 saat sonunda tüm hücre dizilerinde hücrelerin %80’inden fazlası başarılı bir şekilde GFP genini ifade etmiştir. Sonuç: Sonuç olarak, SeV vektörleri melanoma hücrelerini yüksek verimlilikle transdükte edip gen ifadesini sağlamıştır. Bu çalışma SeV vektörlerinin melanoma orijinli hücrelerdeki kullanımını açığa çıkarmış ve SeV vektörlerinin kullanımını içeren kanser tedavi ve hücre programlama alanındaki gelecek çalışmalarına destek sağlamıştır
Efficient transduction of melanoma cells with Sendai viral vectors
Objective: Various viral vectors have been developed in order to delivery genes to living cells. Sendai virus SeV vectors are important viral vectors due to their properties suitable for gene delivery including transient gene expression, wide host cell specificity, low pathogenicity and strong immunogenicity. SeVs vectorss are highly used in molecular medicine in gene therapy, vaccine technology and regenerative.Methods: It was evaluated the gene delivery efficiency of SeV particles in various melanoma cell lines by using fluorescence microscope and confocal laser scanning microscope imaging techniques. A375, MDAMB-435, G361 and WM115 cells have been transduced with SeV vectors expressing green fluorescent protein GFP at different multiplicity of infections MOI : 1, 3, and 9. GFP expression was checked at 24 and 48 hours later following transduction. Confocal laser scanning microscopy imaging was calculated to gene delivery efficiency.Results: It was showed that A375, MDA-MB-435, G361 and WM115 cells are efficiently tranduced by seV even at low virus concentration with fluorescence microscopy imaging. GFP reporter gene activity started to be observed in 24 hours and peaked in 48 hours following viral transduction. Slight toxicity was observed hücrelerde hafif toksisite gözlemlenmiş olsa da 48 saat sonrasında hücreler toksisite etkisinden kurtularak çoğalmış ve verimli şekilde gen ifadesi göstermişlerdir. Konfokal lazer taramalı mikroskop görüntüleme sonucuna göre 48 saat sonunda tüm hücre dizilerinde hücrelerin %80’inden fazlası başarılı bir şekilde GFP genini ifade etmiştir. Sonuç: Sonuç olarak, SeV vektörleri melanoma hücrelerini yüksek verimlilikle transdükte edip gen ifadesini sağlamıştır. Bu çalışma SeV vektörlerinin melanoma orijinli hücrelerdeki kullanımını açığa çıkarmış ve SeV vektörlerinin kullanımını içeren kanser tedavi ve hücre programlama alanındaki gelecek çalışmalarına destek sağlamıştır
___
- 1. Lamb RA, Kolakofsky D. Paramyxoviridae: The
Viruses and Their Replication In: D. M. Knipe, P. M.
Howley, D. E. Griffin, R. A. Lamb, M. A. Martin, B.
Roizman, and S. E. Straus (eds.), Fields virology,
4th ed., Philadelphia, Lippincott Williams &
Wilkins, 2001:1305-40
- 2. Li H-O, Zhu Y-F, Asakawa M, Kuma H, Hirata T,
Ueda Y, et al. A Cytoplasmic RNA Vector Derived
from Nontransmissible Sendai Virus with Efficient
Gene Transfer and Expression. J Virology,
2000;74(14):6564-9.
- 3. Eguchi A, Kondoh T, Kosaka H, Suzuki T, Momota H,
Masago A, et al. Identification and Characterization
of Cell Lines with a Defect in a Post-adsorption
Stage of Sendai Virus-mediated Membrane Fusion.
J Biol Chem, 2000;275(23):17549-55.
- 4. Bitzer M, Armeanu S, Lauer UM, Neubert WJ. Sendai
virus vectors as an emerging negative-strand RNA
viral vector system. J Gene Med, 2003;5(7):543-53.
- 5. Yonemitsu Y, Kitson C, Ferrari S, Farley R,
Griesenbach U, Judd D, et al. Efficient gene
transfer to airway epithelium using recombinant
Sendai virus. Nat Biotech. 2000;18(9):970-3.
- 6. Masaki I, Yonemitsu Y, Komori K, Ueno H, Nakashima
Y, Nakagawa K, et al. Recombinant Sendai virusmediated gene transfer to vasculature: a new class
of efficient gene transfer vector to the vascular
system. FASEB J, 2001;15(7)1294-6.
- 7. Murakami Y, Ikeda Y, Yonemitsu Y, Tanaka S, Kondo
H, Okano S, et al. Newly-developed Sendai virus
vector for retinal gene transfer: reduction of innate
immune response via deletion of all enveloperelated genes. J Gene Med, 2008;10(2):165-76.
- 8. Fujita S, Eguchi A, Okabe J, Harada A, Sasaki K,
Ogiwara N, et al. Sendai Virus-Mediated Gene
Delivery into Hepatocytes via Isolated Hepatic
Perfusion. Biol Pharm Bull, 2006;29(8):1728-34.
- 9. Goto T, Morishita M, Nishimura K, Nakanishi
M, Kato A, Ehara J, et al. Novel Mucosal Insulin
Delivery Systems Based on Fusogenic Liposomes.
Pharmaceut Res, 2006;23(2):384-91.
- 10. Shibata S, Okano S, Yonemitsu Y, Onimaru M,
Sata S, Nagata-Takeshita H, et al. Induction of
Efficient Antitumor Immunity Using Dendritic Cells
Activated by Recombinant Sendai Virus and Its
Modulation by Exogenous IFN-β Gene. J Immunol,
2006;177(6):3564-76.
- 11. Nishimura K, Sano M, Ohtaka M, Furuta B, Umemura
Y, Nakajima Y, et al. Development of Defective
and Persistent Sendai Virus Vector: A unique
gene delivery/expression system ideal for cell
reprogramming. J Biol Chem, 2011;286(6):4760-71.
- 12. Mochiduki Y, Okita K. Methods for iPS cell generation
for basic research and clinical applications.
Biotechnol J, 2012;7(6):789-97.
- 13. Saga K, Kaneda Y. Virosome Presents Multimodel
Cancer Therapy without Viral Replication. Biomed
Res Int, 2013;2013:764706.
- 14. dUra T, Okuda K, Shimada M. Developments in Viral
Vector-Based Vaccines. Vaccines, 2014;2(3):624.
- 15. Mahito N, Makoto O. Development of Sendai Virus
Vectors and their Potential Applications in Gene
Therapy and Regenerative Medicine. Curr Gene
Ther, 2012;12(5):410-6.
- 16. Oishi K, Noguchi H, Yukawa H, Inoue M, Takagi S,
Iwata H, et al. Recombinant Sendai Virus-Mediated
Gene Transfer to Mouse Pancreatic Stem Cells. Cell
Transplant, 2009;18(5):573-80
- 17. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of Pluripotent
Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult
Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell,
2006;126(4):663-76.
- 18. de Lázaro I, Yilmazer A, Kostarelos K. Induced pluripotent
stem (iPS) cells: A new source for cell-based therapeutics?
J Control Release, 2014;185:37-44.
- 19. Choi J, Lee S, Mallard W, Clement K, Tagliazucchi GM, Lim
H, et al. A comparison of genetically matched cell lines
reveals the equivalence of human iPSCs and ESCs. Nat
Biotech, 2015;33(11):1173-81.
- 20. Zhang X-B. Cellular Reprogramming of Human
Peripheral Blood Cells. Genomics Proteomics
Bioinformatics, 2013;11(5):264-74
- 21. Bueno C, Sardina JL, Di Stefano B, Romero-Moya
D, Munoz-Lopez A, Ariza L, et al. Reprogramming
human B cells into induced pluripotent stem cells
and its enhancement by C/EBP[alpha]. Leukemia,
2015;30(3):674-82.
- 22. Miere C, Devito L, Ilic D. Sendai Virus-Based
Reprogramming of Mesenchymal Stromal/Stem Cells
from Umbilical Cord Wharton’s Jelly into Induced
Pluripotent Stem Cells. In: Turksen K, Nagy A, editors.
Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells. Methods in
Molecular Biology. 1357: Springer New York; 2016:33-
44
- 23. Yilmazer A, de Lázaro I, Taheri H. Reprogramming
cancer cells: A novel approach for cancer therapy
or a tool for disease-modeling? Cancer Lett,
2015;369(1):1-8.