Nilüfer UZUNBAYIR-AKEL, Yamaç TEKİNTAŞ, Fethiye Ferda YILMAZ, İsmail ÖZTÜRK, Mustafa OKEER, Sabire Şöhret AYDEMİR, Feriha Feriha ÇİLLİ, Mine HOŞGÖR-LİMONCU

Klinik Pseudomonas aeruginosa izolatlarının virülans özellikleri ve epidemiyolojik ilişkisi

Amaç: Pseudomonas aeruginosa konak savunmasının bozulduğu durumlarda, özellikle sağlık kuruluşlarında ciddi enfeksiyonlara neden olabilen fırsatçı patojendir. Direnç problemine ek olarak bu bakterilerin sahip oldukları farklı virülans özellikleri enfeksiyonun ve tedavinin seyrini değiştirebilmektedir. Bu çalışmada çeşitli kliniklerden izole edilen P. aeruginosa izolatlarının antibiyotik duyarlılıklarının, epidemiyolojik ilişkilerinin ve virülans faktörleri özelliklerinin saptanması amaçlanmıştır. Yöntem: Bu çalışma Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi’nin farklı kliniklerinden izole edilen 83 P. aeruginosa izolatı ile gerçekleştirildi. Etken olan izolatların antibiyotik duyarlılıkları VITEK 2 Compact® otomatize sistemiyle ve klonal ilişkileri “Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polimeraz Zincir Reaksiyonu ERIC-PZR ” ile araştırıldı. Her bir klondan seçilen temsilcilerin virülans faktörlerinin belirlenebilmesi için fenotipik testler yapıldı. Elastaz aktivitesinin araştırılmasında “Elastin Congo Red” ölçüm yöntemi kullanılırken, Proteaz, DNaz, Lipaz, Siderofor ve Hareket Twitching aktivitelerinin fenotipik olarak belirlenmesi amacıyla uygun yöntemler uygulandı. İzolatların biyofilm üretimleri kristal viyole metoduyla ve biyofilmle ilişkili olduğu düşünülen çoğunluğu algılama ÇA genleri ise PZR yöntemiyle araştırıldı. Bulgular: Antibiyotik duyarlılık testi sonuçlarına göre en yüksek direnç imipeneme karşı %43,4 , en düşük direnç ise amikasine karşı %14,5 gözlendi. İzolatların ERIC-PZR sonuçlarına göre 19 ilişkisiz klon içerisinde yer aldıkları saptandı. Her bir klonu temsilen seçilen izolatların tamamında siderofor ve elastaz üretimi gözlendi, proteaz, lipaz ve twitching motilitesi sırasıyla 5, 14 ve 15 izolatta belirlenirken, hiçbir kökende DNAz üretimi saptanmadı. 19 temsilci izolatın dokuzunun güçlü biyofilm ürettiği ve lasI, lasR, rhlR genlerini sırasıyla 17, 18, 13 izolatta, rhlI geninin ise tüm izolatlarda pozitif olduğu belirlendi. Sonuç: Bulgular değerlendirildiğinde, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi’nde farklı antibiyotik direnç profilleri olan P. aeruginosa izolatları saptandı. Bu dirençli izolatların epidemiyolojik olarak ilişkisiz klonlarda yer almaları, genotipik olarak farklı özelliklere sahip izolatların kliniklerde dolaşımda olduklarını göstermektedir. Patogeneze katkıda bulunabilecek pek çok virülans faktörünü de içeren bu izolatlarda özellikle biyofilm üretiminin yaygın olduğu dikkat çekmektedir. Bu durum hem tedavinin daha zor hale gelmesini, hem de sağlık kuruluşlarında pek çok farklı yüzeyde kolonize olabilmelerine katkıda bulunduklarını düşündürmektedir. Ülkemizde ve bölgemizde yapılacak daha kapsamlı çalışmalarla P. aeruginosa bakterilerinin direnç durumları ve virülans faktörlerinin, enfeksiyonun şiddetine olan etkileri ortaya konulabilecektir.

Anahtar Kelimeler:

Pseudomonas aeruginosa, ERICPZR, virülans faktörleri, biyofilm

The virulence characteristics and epidemiological relationship of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates

Objective: Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that can cause serious infections, especially in health care settings where host defense is impaired. In addition to resistance problem, the different virulence characteristics of these bacteria can change the course of infection and cure. In this study, it was aimed to determine antibiotic susceptibilities, epidemiological relations and virulence factors of clinical P. aeruginosa isolates. Methods: This study was performed, a total of 83 P. aeruginosa isolated from different clinical samples of Ege University Faculty of Medicine Hospital. Antibiotic susceptibilities of isolates were investigated by the VITEK 2 Compact® automated system and epidemiological relations of isolates determined via “Enterobacterial Repetitive Intergenic ConsensusPolymerase Chain Reaction ERIC-PCR ”. Phenotypic tests were performed to determine the virulence factors of the selected representatives from each clone. While the “Elastin Congo Red” method was used for the investigation of elastase activity, appropriate methods applied for Protease, DNase, Lipase, Siderophore and Twitching activities to the detect virulence properties phenotypically. The biofilm production of isolates was investigated by crystal violet method, and the quorum sensing QS genes thought to be related to biofilm were determined by PCR method. Results: According to results of antibiotic susceptibility test, the highest resistance was observed against imipenem 43,4% and the lowest resistance was observed against amikacin 14,5% . Isolates were found in 19 unrelated clones according to ERIC-PZR results. Siderophore and elastase production were observed in all of the representative isolates. Protease, lipase and twitching motility were determined at 5, 14 and 15 isolates respectively, no DNAse production was detected. Nine of the 19 representative isolates produced strong biofilms, and the lasI, lasR, rhlR genes were identified in 17, 18, 13 isolates respectively and the rhlI gene was found in all strains. Conclusion: When the data were evaluated, different antibiotic resistant P. aeruginosa isolates which have different resistance profiles were detected at Ege University Faculty of Medicine Hospital. The inclusion of these resistant isolates in epidemiologically unrelated clones suggests that isolates with genotypically different properties are circulating in the clinics. Despite the many virulence factors that can contribute to pathogenesis, it is noteworthy that biofilm production is particularly prevalent in these isolates. This situation has meant that treatment becomes more difficult, as well as being able to colonize on many different surfaces in health care facilities. More extensive studies in both our country and our region could show the resistance profile of P. aeruginosa bacteria and the effects of virulence factors on the severity of infection.

Keywords:

Pseudomonas aeruginosa, ERIC-PCR, virulence factors, biofilm,

PDF

___

1. Özünel L, Boyacıoğlu Zİ, Güreser AS, TaylanÖzkan A. Çorum Eğitim ve Araştırma Hastanesinde derin trekeal aspirat örneklerinden izole edilen Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii suşlarının antimikrobiyal duyarlılık paternlerinin değerlendirilmesi. Turk Hij Den Biyol Derg. 2014;71(2):81–8.
2. Varin A, Valot B, Cholley P, Morel C, Thouverez M, Hocquet D, et al. High prevalence and moderate diversity of Pseudomonas aeruginosa in the U-bends of high-risk units in hospital. Int J Hyg Environ Health. 2017;220(5):880–5.
3. Witney AA, Gould KA, Pope CF, Bolt F, Stoker NG, Cubbon MD, et al. Genome sequencing and characterization of an extensively drug-resistant sequence type 111 serotype O12 hospital outbreak strain of Pseudomonas aeruginosa. Clin Microbiol Infect. 2014;20(10):O609-18.
4. Karatuna O, Yağcı A. Pseudomonas aeruginosa’ da virülans faktörleri ve quorum sensing. Türk Mikrobiyol Cem Derg. 2008;38(1):42–51.
5. Mataraci E, Gerceker AA. Çeşitli dezenfektanların minimum bakterisidal konsantrasyonlarının Pseudomonas aerugınosa’nın biyofilm kültürlerine karşı araştırılması. Ankem Derg. 2012;25(4):209–14.
6. Kozirog A, Otlewska A, Brycki B. Viability, Enzymatic and Protein Profiles of Pseudomonas aeruginosa Biofilm and Planktonic Cells after Monomeric/ Gemini Surfactant Treatment. Molecules. 2018;1– 13.
7. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Third Informational Supplement. Vol. 33, Clinical and Laboratory Standards Institute. 2013. 70-71 p.
8. Dorneles EMS, Santana JA, Ribeiro D, Dorella FA, Guimarães AS, Moawad MS, et al. Evaluation of ERIC-PCR as genotyping method for Corynebacterium pseudotuberculosis isolates. PLoS One. 2014;9(6):e98758.
9. Schaber JA, Carty NL, McDonald NA, Graham ED, Cheluvappa R, Griswold JA, et al. Analysis of quorum sensing-deficient clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. J Med Microbiol. 2004;53(9):841–53.
10. Finlayson EA, Brown PD. Comparison of Antibiotic Resistance and Virulence Factors in Pigmented and Non-pigmented Pseudomonas aeruginosa. West Indian Med J. 2011;60(1):24–32.
11. Wang H, Tu F, Gui Z, Lu X, Chu W. Antibiotic Resistance Profiles and Quorum Sensing-Dependent Virulence Factors in Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa. Indian J Microbiol. 2013;53(2):163–7.
12. Muhsin TM, Aubaid AH, Al-Duboon AH. Extracellular enzyme activities of dermatophytes and yeast isolates on solid media. Mycoses. 1997;40(11– 12):465–9.
13. Eijkelkamp BA, Stroeher UH, Hassan KA, Papadimitrious MS, Paulsen IT, Brown MH. Adherence and motility characteristics of clinical Acinetobacter baumannii isolates. FEMS Microbiol Lett. 2011;323(1):44–51.
14. Louden BC, Haarmann D, Lynne AM. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. J Microbiol Biol Educ. 2011;12(1):51–3.
15. Lima JL da C, Alves LR, Jacomé PRL de A, Bezerra Neto JP, Maciel MAV, Morais MMC de. Biofilm production by clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa and structural changes in LasR protein of isolates non biofilm-producing. Brazilian J Infect Dis. 2018;22(2):129–36.
16. Stepanović S, Vuković D, Dakić I, Savić B, ŠvabićVlahović M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J Microbiol Methods. 2000;40(2):175–9.
17. Stepanovic S, Vukovic D, Hola V, Bonaventura G Di, Djukic´ S, Cirkovic´ I, et al. Quantification of Biofilm in Microtiter Plates: Overview of Testing Conditions and Practical Recommendations for Assessment of Biofilm Production by Staphylococci. Apmis. 2007;115(3):891–9.
18. Öztürk C, Albayrak HT, Altinöz A, Ankarali H. Pseudomonas aeruginosa Suşlarinda Antibiyotiklere Direnç ve Beta-Laktamaz Oranları. ANKEM Derg. 2010;24(3):117–23.
19. Livermore DM. Leading article Of Pseudomonas, porins, pumps and carbapenems. J Antimicrob Chemother. 2001;47:247–50.
20. Rostami S, Farajzadeh SA, Shoja S, Farahani A, Tabatabaiefar MA, Jolodar A, et al. Investigating of four main carbapenem-resistance mechanisms in high-level carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa isolated from burn patients. J Chinese Med Assoc. 2018;81(2):127–32.
21. Liu Q, Li X, Li W, Du X, He JQ, Tao C, et al. Influence of carbapenem resistance on mortality of patients with Pseudomonas aeruginosa infection: A metaanalysis. Sci Rep. 2015;5(March):1–10.
22. Metan G, Akova M. Reducing the impact of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae on vulnerable patient groups: What can be done? Curr Opin Infect Dis. 2016;29(6):555–60.
23. Plüss-Suard C, Pannatier A, Kronenberg A, Mühlemann K, Zanetti G. Impact of antibiotic use on carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa: Is there a role for antibiotic diversity? Antimicrob Agents Chemother. 2013;57(4):1709–13.
24. Juayang AC, Lim JPT, Bonifacio AF V, Lambot AVL, Millan SM, Sevilla VZJN, et al. Five-Year Antimicrobial Susceptibility of Pseudomonas aeruginosa from a Local Tertiary Hospital in Bacolod City, Philippines. Trop Med Infect Dis. 2017;2(3):28.
25. Lucca F, Guarnieri M, Ros M, Muffato G, Rigoli R, Da Dalt L. Antibiotic resistance evolution of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis patients (2010- 2013). Clin Respir J. 2018;12:2189–96.
26. Poole K. Aminoglycoside Resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49(2):479–87.
27. Lambert PA. Mechanism of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa. J R Soc Med. 2002;95(41):S22-26.
28. Smith RS, Iglewski BH. Pseudomonas aeruginosa quorum sensing as a potential antimicrobial target. J Clin Invest. 2003;112(10):1460–5.
29. de Kievit TR. Quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 2009;11(2):279– 88.
30. Mukherjee S, Moustafa D, Smith CD, Goldberg JB, Bassler BL. The RhlR quorum-sensing receptor controls Pseudomonas aeruginosa pathogenesis and biofilm development independently of its canonical homoserine lactone autoinducer. PLoS Pathog. 2017;13(7):1–25.
31. Orlandi VT, Bolognese F, Chiodaroli L, Tolker-Nielsen T, Barbieri P. Pigments influence the tolerance of Pseudomonas aeruginosa PAO1 to photodynamically induced oxidative stress. Microbiology. 2015;161(12):2298–309.
32. Morales E, Gonźalez-Valdez A, Servin-Gonźalez L, Sobeŕon-Chavez G. Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing response in the absence of functional LasR and LasI proteins: The case of strain 148, a virulent dolphin isolate. FEMS Microbiol Lett. 2017;364(12):1–10.
33. Georgescu M, Gheorghe I, Curutiu C, Lazar V, Bleotu C, Chifiriuc MC. Virulence and resistance features of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from chronic leg ulcers. BMC Infect Dis. 2016;16(1):3–9.
34. Holban AM, Chifiriuc MC, Cotar AI, Bleotu C, Grumezescu AM, Banu O, et al. Virulence markers in Pseudomonas aeruginosa isolates from hospitalacquired infections occurred in patients with underlying cardiovascular disease. Rom Biotechnol Lett. 2013;18(6):7243–54.
35. Le Berre R, Nguyen S, Nowak E, Kipnis E, Pierre M, Ader F, et al. Quorum-sensing activity and related virulence factor expression in clinically pathogenic isolates of Pseudomonas aeruginosa. Clin Microbiol Infect. 2008;14(4):337–33.