Demet GÜR VURAL, Yeliz TANRIVERDİ ÇAYCI, İlknur BIYIK, Kemal BİLGİN, Asuman BİRİNCİ

Evaluation of immunoblotting test results in patients with positive antinuclear antibodies

Objective: Autoimmune diseases occur as a result of the immune response to self antigens and tissues of the organism and the detection of autoantibodies is very important in the diagnosis of these disorders. Antinuclear antibodies (ANA) autoantibodies generated against to nuclear/ cytoplasmic components of the cell are important diagnostic criteria for connective tissue diseases. Currently, a number of methods are available for the detection of ANA. The gold standard method for the detection of ANA is Indirect Immunofluorescence Antibody (IIFA) assay using Hep2 (human laryngeal epidermoid carcinoma). When positive results are observed, Extractable Nuclear Antigen( ENA) tests follow as a means of confirming the diagnosis. Identification of the specific extractable nuclear antigens is warranted because this may further differentiate between the distinct types of autoimmune connective tissue diseases. In this study, were analyzed retrospectively that ENA test results in patients with positive ANA IIFA test. Methods: Antinuclear antibodies were tested for a total of 3000 patients admitted to various clinics of Ondokuz Mayıs University Medical Faculty. Each serum sample was studied at 1: 100 dilution in accordance with the manufacturer’s recommendations (Euroimmun AG, Lübeck, Germany) and staining pattern with fluorescence intensity was evaluated with immunofluorescence microscope. ENA was investigated by immunoblotting method (Euroimmun AG, Lübeck, Germany) in 640 ANA positive sera. Results: Distribution of the patients included in the study, 2192 (73.07%) were female and 808 (26.93%) were male. 640 samples detected as ANA positive. When we look at the distribution of ANA patterns in positive samples; granular 173 (27.03%), granular and cytoplasmic granular 98 (15.31%), homogenous and granular 67 (10.47%) were the most common. When the ENA profiles of the ANApositive samples were examined, 557 (83.7%) were found to be positive and 83 (12.97%) were negative. According to our study, SSA (26.88%), SSB (17.81%), Sm / RNP (17.66%) were the first three places in the ENA positivite. Conclusion: Our ANA positivity rate was found to be compatible with the literature. The pattern distribution is similar to the data of our region. After the first screening with IIFA, looking for different antigens with the immunoblot test; not only it is a cost effective approach;but also facilitate the diagnosis of autoimmune diseases.

Antinükleer antikorların pozitif saptandığı hastalarda immunoblotting test sonuçlarının değerlendirilmesi

Amaç: Otoimmün hastalıklar, organizmanın kendi doku ve hücrelerine karşı immün yanıt gelişmesi sonucu oluşmaktadır ve bu hastalıkların tanısında otoantikorlar büyük önem taşımaktadır. Anti nükleer antikor (ANA) adı verilen, hücre nükleusu ve/veya sitoplazmasındaki nükleer yapılara karşı gelişen otoantikorlar, bağ doku hastalıklarında önemli bir tanı kriteridir. Günümüzde, ANA pozitifliğinin saptanması amacıyla geliştirilmiş bir çok yöntem bulunmaktadır. ANA tespiti için altın standart yöntem, Hep2 (insan laryngeal epidermoid karsinoma) hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen Indirekt Immünofloresan Antikor (IIFA) testidir. Pozitif sonuçlar gözlendiğinde, tanıyı doğrulamanın bir yolu olarak, ekstrakte edilebilir nükleer antijen (ENA) testleri takip eder. Spesifik ekstrakte edilebilir nükleer antijenlerin tanımlanması, otoimmün bağ dokusu hastalıklarının farklı tipleri arasındaki ayrımı sağlayabilir. Bu çalışmada, ANA IIFA testi pozitif olan hastalarda ENA test sonuçlarını retrospektif olarak inceledik. Yöntem: Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi’nin çeşitli kliniklerine başvuran toplam 3000 hasta için Anti nükleer antikorlar test edildi. Her serum numunesi 1: 100 dilüsyonda üreticinin (Euroimmun AG, Lübeck, Germany) önerileri doğrultusunda çalışılmış, immunfloresan mikroskopta boyanma paterni ve floresans şiddeti değerlendirilmiştir. ANA pozitif olarak tespit edilen 640 numunede immunoblot yöntemi (Euroimmun AG, Lübeck, Germany) ile ENA test edilmiştir. Bulgular: Çalışmaya alınan hastaların 2192’si (%73,07) kadın, 808’i (%26,93) erkekti. 640 numune ANA pozitif olarak tespit edilmiştir. Pozitif örneklerde ANA paternlerinin dağılımına baktığımızda;173 granüler (%27,03), 98 granüler+sitoplazmik granüler (%15,31), 67 homogen+granüler(%10,47) en sık saptanmıştır. ANA pozitif örneklerin ENA profilleri incelendiğinde 557’si (%83,7) pozitif, 83’ü (%12,97) negatif bulundu. ENA pozitifliklerinde ilk üç sırayı SSA (%26,88), SSB (%17,81), Sm/RNP (%17,66) aldı. Sonuç: ANA pozitiflik oranımız literatür ile uyumlu bulunmuştur. Patern dağılımı da bölgemiz verilerine benzerdir. IIFA ile ilk tarama ardından immunoblot test ile farklı antijenlere bakılması; maliyet etkin bir yaklaşım olmakla birlikte; otoimmün hastalıkların tanısını kolaylaştıracaktır.

PDF

___

1. Smeenk RJ. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease? Rheumatology, 2000;39(6):581-4.

2. Yılmaz Ö, Karaman M, Ergon MC, Bahar İH, Yuluğ N. Konnektif doku hastalıklarının tanısında Antinükleer (ANA) veAnti-doublestran¬ded DNA (anti-dsDNA) antikorlarının önemi. T Parazitol Derg, 2005;29:287-290.

3. Afşar İ, Şener AG, Vural A, Hızlı N, Türker M. Anti nükleer antikorların pozitif saptandığı hastalarda immunoblotting test sonuçlarının değerlendirilmesi. Türk Mikrobiyol Cem Derg, 2007;37(1):39-42.

4. Meroni PL, Schur PH. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis, 2010;69:1420-2.

5. Au EY, Ip WK, Lau CS, Chan YT. Evaluation of a multiplex flow immunoassay versus conventional assays in detecting autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Hong Kong Med J, 2018;24(3):261- 9.

6. Us D, Şener B, Hasçelik G, Günalp A. Investigation of the Presence of Antibodies to Extractable Nuclear Antigens (Anti-ENA) by Immunoblot Techniquen in Systemic Lupus Erythematosus Patients. Mikrobiyol Bul, 1997;31:155-63.

7. Damoiseaux JG, Tervaert JW. From ANA to ENA: How to Proceed? Autoimmunity Reviews, 2006;5(1):10-7.

8. Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al. The american rheumatism association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1988;31:315 – 24.

9. Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, Moutsopoulos HM, Alexander EL, Carsons SE, et al. Classification criteria for Sjogren’s syndrome: a revised version of the European criteria proposed by the American– European Consensus Group. Ann Rheum Dis, 2002;61:554 – 8.

10. 1Watson RM, Lane AT, Barnett NK, Bias WB, Arnett FC, Provost TT. Neonatal lupus erythematosus. A clinical, serological and immunogenetic study with review of the literature. Medicine (Baltimore), 1984;63:362–78.

11. Singsen BH, Akhter JE, Weinstein MM, Sharp GC. Congenital complete heart block and SSA antibodies: obstetric implications. Am J Obstet Gynecol, 1985;152:655–8.

12. Hu PQ, Fertig N, MedsgerJr TA, Wright TM. Correlation of serum anti-DNA topoisomerase I antibody levels with disease severity and activity in systemic sclerosis. Arthritis Rheum, 2003;48:1363– 73.

13. Güdücüoğlu H, Yaman G, Çıkman A, Çalışır U, Berktaş M. Retrospective evaluation of immunoblotting (IB) test results in anti-nuclear antibody positive patients. Turkish J Clin Lab, 2011;2:59-62.

14. Górniak G B, Rogacka N, Puszczewicz M. Antinuclear antibodies in healthy people and non-rheumatic diseases – diagnostic and clinical implications. Reumatologia, 2018; 56, 4: 243–8.

15. Li QZ, Karp DR, Quan J, Branch VK, Zhou J, Lian Y, veark. Risk factors for ANA positivity in healthy persons. Artritis Res Ther, 2011;13(2):R38.

16. Mengeloğlu Z, Taş T, Kocoglu E, Aktaş G, Karabörk S. Determination of anti-nuclear antibody pattern distribution and clinical relationship. Pak J Med Sci, 2014;30:380–3.

17. Çelikbilek N, Özdem B, Açıkgöz ZC. Evaluation of Anti-Nuclear antibody test results in clinical practice. J Microbiol Infect Diseas, 2015;5(2):63-8.

18. Karakeçe E, Atasoy AR, Çakmak G, ve ark. Bir üniversite hastanesinde antinükleer antiko rpozitiflikleri. Turk J Immunol, 2014;2:58.

19. Aktar GS, Ayaydın Z, Onur AR, Vural DG, Temiz H. Bir Eğitim ve Araştırma Hastanesinde İFA Yöntemiyle Çalışılan Otoantikor Sonuçlarının Retrospektif Olarak Değerlendirilmesi. Turk J Immunol, 2017; 5(3)77−81.

20. Agmon-Levin N, Damoiseaux J, Kallenberg C, Sack U, Witte T, Herold M, et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis, 2014;73:17–23

21. Kaklıkkaya N, Akıneden A, Topbaş M, Aydın F. Determination of anti-nuclear antibody seroprevalence in adult age groups in Trabzon province. Balkan Med J, 2013;30:343-4

22. Evrensel N, Arslan F, Gödekmerdan A. Antinükleer antikorların retrospektif olarak değerlendirilmesi. 2. Ulusal Klinik Mikrobiyoloji Kongresi. Kasım, 10– 13, Antalya-Türkiye. 2013

23. Yumuk Z, Çalışkan Ş, Gündeş S, Willke A. Anti- Nükleer antikorların araştırılması ve saptanmasında kullanılan teknikler. Türk Mikrobiyol Cem Derg, 2005;35(1):40-4