TEK GEN HASTALIĞI VE HLA UYUMUNDA PREİMPLANTASYON GENETİK TANI: TEK MERKEZ DENEYİMİ

Amaç: Preimplantasyon Genetik Tanı (PGT)’da tek gen hastalıkları taraması ile kombine HLA doku tiplemesi tayini TalasemiMajör gibi yaşamı tehdit eden ve kordon kanı ve /veya kemik iliği nakli ile tam olarak tedavi edilebilen genetik hastalıklarasahip çocuklar için etkin bir yöntemdir. Bu çalışmada, Sağlık Bilimleri Üniversitesi Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim AraştırmaHastanesi Genetik Tanı Merkezi Preimplantasyon Genetik Tanı Laboratuvarında 2014-2017 Mayıs döneminde çalışılanvakaların verileri sunulmuştur.Gereç ve Yöntem: Laboratuvarımıza Sağlık Bilimleri Üniversitesi Etlik Zübeyde Hanım Kadın Hastalıkları Tüp BebekMerkezinden gelen 6-8 blastomer aşamasındaki 3. Gün embriyolarından alınan biyopsi örneklerinde preimplantasyongenetik tanı uygulamaları yapılan 91 vakanın genetik analiz sonuçları, mutasyon tipleri, implantasyon ve gebelik başarısı ilecanlı doğum oranları değerlendirildi. Biyopsi örneklerine uygulanan lizis işleminin ardından REPLI-g Advanced DNA SingleCell Kit (Qiagen, USA) ile Whole Genom Amplification (Biorad T100, USA) gerçekleştirildikten sonra mutasyonu taşıyanDNA fragmentlerinin ve HBB geni ile ilişkili 11 markırın belirlenebilir seviyeye kadar multiplex Polimeraz Zincir Reaksiyonu(PZR) ile çoğaltılması yapıldı. Amplifikasyondan sonra DNA, normal DNA fragmentlerini mutasyonu taşıyan fragmentlerdenayırt etmeye olanak sağlayan mini-sekanslama tekniği ile kapiller elektroforez kullanılarak analiz edildi. Seçilmiş LinkedMarkerlar (STR: Short Tandem Repeat/ Kısa tekrar dizileri) mutasyonun tanısı için bir destek oluşturma ve bazı DNAkontaminasyonlarının belirlenmesi amacıyla kullanıldı. HLA tipleme analizlerinde uyumlu HLA genotiplerinin belirlenmesiiçin HLA kompleksi ile ilişkilendirilen 32 markır, multipleks PZR ile çalışılarak DNA fragmentleri kapiller elektroforezkullanılarak analiz edildiBulgular: 86 vaka Beta Talasemi (HBB geni) , bir vaka Orak Hücreli Anemi (HBB geni), bir vaka Blackfan Diamond Anemisi(RPS19 geni), bir vaka akut lenfoblastik lösemi, bir vaka Ağır Konjental Nötropeni (HAX1 geni) ve bir vaka Fankoni AplastikAnemisi (FANCA geni) olmak üzere toplamda 91 vaka çalışıldı. Toplam çalışılan blastomer sayısı 328, transferi yapılan vakasayısı 41, gebelik gerçekleşen vaka sayısı 12, gerçekleşen canlı doğum sayısı 8 ve kemik iliği nakil işlemi yapılan vaka sayısı 6olarak saptandı. Canlı doğumların tümünde gerçekleştirilen ikinci genetik analizde sağlıklı/taşıyıcı gen ve HLA tipinde hastakardeş ile tam uyum görüldü.Sonuç: Sonuçlarımız kemik iliği nakli ile tam kür sağlanan genetik hastalıkların tedavisinde ailede sağlıklı ve HLA uyumluçocuk varlığının önemi açısından anlamlıdır. Diğer preimplantasyon genetik test uygulanan hastalıklarla karşılaştırıldığındatransfer edilebilir blastomer bulma oranının düşük olduğu görülmüş ve bunun blastomerde iki farklı genetik seçilimyapılması gerekliliğinden kaynaklandığı düşünülmüştür.

Single Gene Disorder and HLA Matched Preimplantation Genetic Diagnosis: Single Center Experience

Purpose: Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) of single gene disorders combined with HLA typing is an effective method for life-threatening genetic diseases such as Beta thalassemia major which can be treated with bone marrow transplantation. The aim of this study is to present the data of the cases evaluated between May 2014-May 2017 in the PGD Laboratory of Genetic Diagnosis Center, Dışkapı Yıldırım Beyazıt and Research Hospital, Health Sciences Faculty. Material and Methods: We evaluated the results of genetic analysis, the success of implantation and pregnancy, and the rate of live births of 91 cases which was biopsied from blastomeres of 6-8 stage of the 3th day embryos. After the Whole Genome Amplification with REPLI-g Advanced DNA Single Cell Kit (Qiagen, USA) preceded by the lysis of biopsy samples, DNA fragments and HBB related 11 markers were amplified until the predicted level with polymerase chain reaction (PCR). After the amplification, DNA was analyzed with mini-sequencing technique using capillary electrophoresis in order to distinguish normal DNA fragments from the mutated ones. Selected linked markers were used to support the diagnosis of mutation and determinate DNA contaminants. HLA complex related 32 markers were studied with multiplex PCR and DNA fragments were analyzed using capillary electrophoresis in order to determinate compatible HLA genotypes in HLA typing analyses. Results: We studied a total of 91 cases consisting of 86 cases of beta thalassemia (HBB gene), one case of sickle cell disease (HBB gene), one case of acute lymphoblastic lymphoma, one case of severe congenital neutropenia (HAX1 gene) and one case of Fanconi aplastic anemia (FANCA gene). The total number of blastomeres studied were 328, 41cases were transferred, and there were 12 successful pregnancies with 8 live births. There were also 6 cases which were treated with bone marrow transplantation. The second genetic analysis of all live births revealed that healthy/carrier gene and HLA typing of affected sibling was full matched. Conclusion: Our results have significant importance for the treatment of genetic disease which cure is possible with bone marrow transplantation in the presence of HLA matched sibling. The rate of transferable blastomere were lower than other genetically tested diseases; however, the reason of this difference was probably the necessity of making two different genetic selections.

PDF

___

Edwards RG, Gardner RL. Sexing of live rabbit blastocysts. Nature. 1967; 6;214(5088):576-7.
Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, Winston RM. Pregnan- cies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature. 1990; 19;344(6268):768-70.
Munne S, Wells D. Preimplantation genetic diagnosis. Curr Opin Obstet Gynecol. 2002;14(3):239-44.
Verlinsky Y, Rechitsky S, Schoolcraft W, Strom C, Kuliev A. Preim- plantation diagnosis for Fanconi anemia combined with HLA match- ing. JAMA. 2001 27;285(24):3130-3.
Kahraman S, Karlıkaya G, Kumtepe Y, Sertyel S, Karadayı H, Fındıklı N, et al. Tek gen hastalıklarında preimplantasyon genetik tanı ve HLA doku tiplemesi uygulamalarının klinik değerlendirmesi. Türk Fertilite Derg. 2004;12 (1): 43-53.
Kahraman S, Beyazyurek C, Yesilipek MA, Ozturk G, Ertem M, Anak S, et al. Successful haematopoietic stem cell transplantation in 44 children from healthy siblings conceived after preimplantation HLA matching. Reprod Biomed Online. 2014; 29(3):340-51.
Kakourou G, Vrettou C, Kattamis A, Destouni A, Poulou M, Moutafi M, et al. Complex preimplantation genetic diagnosis for beta-thalassaemia, sideroblastic anaemia, and human leukocyte antigen (HLA)-typing. Syst Biol Reprod Med. 2016;62(1):69-76.
Kakourou G, Vrettou C, Moutafi M, Traeger-Synodinos J. Pre- implantation HLA matching: The production of a Saviour Child. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2017;44:76-89.
Kakourou G, Kahraman S, Ekmekci GC, Tac HA, Kourlaba G, Kourkouni E, et al. The clinical utility of PGD with HLA match- ing: a collaborative multi-centre ESHRE study. Human Reprod 2018;33(3):520-30
Göktolga Ü, Korkmaz C, Bahçe M, Ceyhan ST, Keskin U, Başer İ. Preimplantasyon genetik tanı: GATA sonuçları. Gülhane Tıp Dergisi 2007;49: 245-9.
Aydın T, Yücel B. Tek Gen Hastalıkları Nedeniyle Preimplantasyon Genetik Tanı Uygulanan Hastalarımızın Retrospektif Analizi. Bozok Tıp Dergisi 2017; 7(4):42-5.
Kahraman S, Ekmekçi CG. Talasemi ve Hemoglobinopatilerde Preimplantasyon Genetik Tanı Yöntemleri. Turkiye Klinikleri J Hem Onc-Special Topics 2010;3(1):44-9.
Rechitsky S, Pakhalchuk T, San Ramos G, Goodman A, Zlato- polsky Z, Kuliev A. First systematic experience of preimplantation genetic diagnosis for single-gene disorders, and/or preimplantation human leukocyte antigen typing, combined with 24-chromosome aneuploidy testing. Fertil Steril. 2015;103(2):503-12.
Goldman KN, Nazem T, Berkeley A, Palter S, Grifo JA. Preimplan- tation genetic diagnosis (PGD) for monogenic disorders: the value of concurrent aneuploidy screening. J Genet Couns. 2016;25:1327–37.
Sermon K. Novel technologies emerging for preimplantation ge- netic diagnosis and preimplantation genetic testing for aneuploidy. Expert Rev Mol Diagn. 2017;17:71–82
Treff NR, Fedick A, Tao X, Devkota B, Taylor D, Scott RT Jr. Evalua- tion of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertil Steril 2013;99:1377– 84 e1376.