Mustafa ÜN, Şükrü KÜPLÜLÜ

The effects of follicle diameter on the in vitro fertilization capacity of bovine oocytes aspirated from the slaugthered ovaries

Bu çalışmada, mezbahadan toplanan ovaryumlardan elde edilen sığır oositlerinin maturasyon ve fertilizasyon oranlarının follikül çapı ile ilişkilendirilerek ortaya konması amaçlanmıştır. Çalışma materyali olarak bölge mezbahalarında kesilen hayvanlardan toplanan 115 ovaryüm kullanıldı. Ovaryumların üzerlerindeki yüzeysel folliküller çaplarına göre (2-6 mm-Grup I ve 6-10 mm-Grup II) sayıldı. Tüm folliküllerin 18 G'lik iğne ile punksiyonları yapılarak oositler aspire edildi. Aspire edilen kumulus-oosit kompleksleri morfolojilerine göre sınıflandırıldı. Yanlızca I. ve II. kalite oositler in vitro maturasyon vasatına (TCM-199+%20 (v/v) ECS+BSA) aktarılarak, 390C sıcaklıkta %5 CO2 atmosferinde 22-24 saat inkübe edildi, înkubasyon sonrası perivitellin boşlukta Ic kutup hücresi ve kümülüs ekspansiyonu görülen oositler mature olarak kabul edilerek in vitro fertilizasyon vasatına (Tyrode'nin albumin laktat piruvat vasatı-TALP) aktarıldı. Fertilizasyon swim-up testi ile immotil spermatozoon populasyonundan ayrıştırılmış, final konsantrasyonu 50x106 spermatozoon/ml olan spermadan 1-2 $mu$l'nin ($1x10^6$) fertilizasyon vasatına aktrarılması ve vasata heparin (10 u.g/ml) eklenerek kapasitasyonun sağlanması ile 39$^circ$C sıcaklıkta %5 $CO_2$ atmosferinde 18-19 saatte gerçekleştirildi. Çalışmanın her basamağına ait veriler kaydedilerek Student's K testi ile istatistiki değerlendirmesi yapıldı. Çalışma sonucunda Grup I'de yer alan 588 (5.1 1±2.39) ve Grup H'de yeralan 300 (2.72±1.58) follikülden aspire edilen toplam ve ovaryüm başına ortalama oosit sayıları sırasıyla 549 (4.77±2.09) ve 275 (2.5 ± 1.87) olarak kaydedildi. Aspirasyon başarıları ise Grup I'de %93.3 ve Grup IF de %91.7 olarak hesaplandı. Grup I'de aspirasyondan sonra I ve II. kalite oldukları belirlenen toplam 549 ve Gıup Il'de 275 cumulus-oosit kompleksinin maturasyon kültürü sonrası Grup I'de 401 ve Grup Il'de ise 217'sinde maturasyonun şekillendiği saptandı. Grup I ve Il'de elde edilen maturasyon yüzdeleri ise sırasıyla %73 ve %78.9 olarak belirlendi (p>0.05). Grup I ve IFye ait mature oositler in vitro fertilizasyon işlemi için kullanıldı. Bu oositlerden Grup I'de 165 (%41,1)'inde ve Grup Il'de 107 (%49.3)'sinde, fertilizasyon kültürü sonrası mikroskobik incelemede, hem erkek hem de dişi pronukleus görülerek fertilize oldukları kabul edildi Sonuç olarak, mezbahadan toplanan sığır ovaryumları in vitro embriyo üretiminde iyi bir kaynak olduğu, ancak toplanan ovaryumların yüzeyindeki folliküllerden aspire edilen oositlerin maturasyon ve fertilizasyon kapasiteleri oldukça değişkenlik gösterdiği ve in vitro çalışmalarda kullanılabilecek oositlerin elde edildikleri folliküllerin çapları ile oositlerin maturasyon ve fertilizasyon başarıları arasında kuvvetli bir ilişki olduğu, follikül ölçüsü arttıkça fertilizasyon oranının yükseldiği sonucuna varıldı.

Mezbahadan toplanan ovaryumlardan aspire edilen sığır oositlerinin in vitro fertilizasyonu üzerine follikül büyüklüklerinin etkisi

The aim of this study was to determine the maturation and fertilization capacities of bovine oocytes aspirated from slaugthered ovaries in relation with the follicle diameter. A number of 115 ovaries collected from the slaugthered cows at a local slaughterhouse were used as the material. Peripheral follicles were counted according to the their diameters (2-6 mm-group I and 6-10 mm-group II). All follicles were punctured with an 18 G needle hold on a 5 ml syringe and aspirated cumulus-oocyte complexes were classified in regard to their morphological apperance. Only Grade I, II and III oocytes were then placed in maturation medium (TCM- 199+%20 (v/v) ECS+BSA) and incubated under an atmosphere of 5% $CO_2$ at 39$^circ$C for 22-24 hr. After IVM, maturated oocytes were fertilized by adding 1-2 $mu$l ($1x10^6$), swim-up separated sperm to the fertilization media (Tyrode's albumin lactate pyruvate medium-TALP) for in vitro fertilization under an atmosphere of 5% $CO_2$ at 39$^circ$C for 18-19 hr. Heparine (10 $mu$g/ml) was used as the capacitating agent. The datas obtained at the all stages were recorded and statistical evaluation was done with the Student's T test. A total of 549 (4.77±2.09) oocytes were aspirated from 588 (5.11±2.39) follicles with an aspiration rate of 93.3% in group I and 275 (2.5+1.87) COC were aspirated from 300 (2.72±1.58) follicles with an aspiration rate of 91.7% in group II. After the maturation period 401 of 549 oocytes in group I and 217 of 275 oocytes in group II were found as mature with a maturation rate of 73% and 78.9%, respectively (p>0.05). In 165 of 401 in group I (41.1%) and 107 of 217 incubated oocytes in group II (49.3%), both male and female pronuclei were detected. As a conclusion, it was evident that the ovaries collected from the slaugtherhouse are sufficient potentials for in vitro embryo production, although a great, variation between the maturation and fertilization capacities of oocytes aspirated from the peripheral follicles could be observed. It was also obvious that there is a significiant relation between the follicle diameter and maturation and fertilization capacities of oocytes since the fertilization rates increases as the follicle diameter rises.

PDF

___

1.A van Soom, A de Kruif (1996): Oocyte maturation, sperm capacitation and preimplantation development in the bovine: Implications for in vitro production of embryos. Reprod Dom Anim, 31, 687-701.
2.A van Soom, A de Kruif (1998): Bovine embriyonic de velopment after in vivo and. in vitro fertilization. Reprod Dom Anim, 33, 261-265.
3.Bols PEJ, yan Soom A, Ysebaert MT, Vandenheede JMM, A de Kruif (1996): Effects of aspiration vacuum and needle diameter on cumulus- ooçyte complex morp hology and developmental capacity of bovine oocytes. The riogenology, 45, 1001-1014. .
4.Carolan C, Monaghan P, Gallagher M, Gordon I (1994): Effect of recovery method on yield of bovine oocytes per ovary and their developmental competence after maturation, fertilization and culture in vitro. The-riogenology, 41, 1061-1068.
5.Farm CE, Hasler JF, Martus NS, Stokes JE (1997): A comparison ofMenezo 's B2 and tissue culture Medium-199 for in vitro production of bovine blastocysts. The- riogenology, 48, 699-709.
6.Gordon I (1994): Laboratory Production of Cattle Emb ryos. Cab International Co, Wallingford.
7.Greve T, Avery B, Callesen H (1993): Viability of in vivo and in vitro produced bovine embryos. Reprod Dom Anim, 28, 164-169.
8.Jewgwnow K, Heerdegen B, Müller K (1999): In vitro development of individually maturated bovine oocytes in relation to follicular wall atresia. Theriogenology, 51, 745-756.
9.Khurana NK, Niemann H (2000): Effects of oocyte qu ality, oxygen tension, embryo density, cumulus cells and energy substrates on cleavage and morula/blastocyst for mation of bovine embryos. Theriogenology, 54, 741-756.
10.Küplülü Ş, Ün M (2000): Mezbahadan elde edilen sığır ovaryumlarında yüzeysel follikül potansiyelinin belirlenmesi ve oosit aspirasyonu. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 47, 247-254.
11.Küplülü Ş, Ün M (2001): Sığırlarda follikül büyüklüğünün oositlerin in vitro maturasyonu üzerine etkisi. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 48, 201-205.
12.Leibfried-Rutledge ML (1999): Factors determining competence of in vitro produced cattle embryos. Therigenology, 51, 473-485.
13.Loos DF, Van Vliet C, Van Maurik P, Kruip Th AM (1989): Morphology of immature bovine oocytes. Gam Res, 27, 197-204.
14.MacCallum C, Salamone D, Palasz AT (1997): Effect of maturation medium supplements on bovine oocyte fertilization and embryo development. Theriogenology, 47, 193-196.
15.Sosnowski J, Switonski M, Lechniak D, Molinski K (1996): Cy to genetic evaluation of in vitro maturated bovine oocytes collected from ovaries of individual donors. The riogenology, 45, 865-872.
16.Telfer EE (1998): In vitro models for oocyte development. Theriogenology, 49, 451-460.
17.Thompson A (1997): Comparison between in vivo derived and in vitro produced preelongation embryos from do mestic ruminants. Reprod Fertil Dev, 9, 341-354.
18.Twagiramungu H, Morin N, Bordignon V, Smith L C, Bousquet D (1997): Influence of serum in culture system on the production and cryopreservation of in vitro-derived bovine embryos. Theriogenology, 47, 356-361.
19.Yamashita S, Satoh T, Hoshi H (1996): Bovine blastocyst formation from TVM/FVF produced zygotes in serum and serum free medium. Theriogenology, 45, 197-201
20.Yang X, Jiang S, Foote RH (1993): Bovine oocyte de velopment following different oocyte maturation and sperm capacitation procedures. Mol Reprod Dev, 34, 94-100.