Rezidüel Tümör Tespiti İçin Bir Sıvı Biyopsi Yöntemi Olarak Alelspesifik Emülsiyon PCR (asePCR)

Amaç: Bu çalışmada kanser hastalarının kan plazmasında sirkülasyondaki hücresiz tümör DNA’sının (ctDNA) saptanışına yönelik alel-spesifik bir emülsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (asePCR) tekniği geliştirmek amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntemler: Normal tip DNA ile mutant DNA’nın spesifik seyreltisini (spike-in) elde etmek için, normal (doğal tip) ve tiroit kanserli (mutant) hücre hatlarından (MCF10A ve B-CPAP) ekstrakte edilen iki tip genomik DNA kullanıldı. asePCR tekniğimizi doğrulamak için BRAFV600E hotspot mutasyonu hedeflendi. İki sıralı PCR adımı (düzenli ve asePCR), normal DNA içindeki mutant DNA fraksiyonunu tespit etmek için her bir adım için özel olarak tasarlanmış primerler ile gerçekleştirildi. Düzenli PCR ile çoğaltılan DNA örnekleri, asePCR’de spesifik olarak tasarlanmış mutant ve normal tip alel-spesifik primerler ve ortak primer ile kovalent olarak bağlanmış olan tanecikler ile birlikte kullanılmıştır. asePCR reaksiyon karışımı, mineral yağ içinde su emülsiyon bölmelerinde kapsüllendi ve spesifik PCR program ayarları ile bir termosistörde inkübe edildi. asePCR reaksiyonunun sonunda, mineral yağ bölmeleri kırıldı ve DNA kaplı taneler FACS ile değerlendirildi ve her örnek için mutant ve normal tip fraksiyonları sayıldı. Bulgular: AsePCR tekniği, prensip kanıtı olarak normal tip DNA’nın (%0 mutant) arka planında mutant DNA’yı başarıyla tespit etti. Bilinen mutant fraksiyonu ile asePCR ile ölçülen fraksiyon arasında güçlü bir korelasyon (r2>0,99) bulundu. AsePCR, normal tipteki örnekte hiçbir yanlış pozitiflik tespit etmediği gibi normal tip örnekteki DNA’nın arka planındaki çeşitli düşük mutant DNA fraksiyonlarını da tutarlı bir şekilde tespit edecek kadar hassas ve spesifikti. Tartışma ve Sonuç: asePCR tekniğimiz, tümör yanıtını değerlendirmeye ve olası relapsları erken teşhise yönelik bir sıvı biyopsi yöntemi olarak, kanser hastalarının plazmasında mutant ctDNA tespiti için kullanılabilir.

Allele-specific Emulsion PCR (asePCR) as a Liquid Biopsy Method for Residual Tumor Detection

Aim: This study aimed to develop an allele-specific emulsion polymerase chain reaction (asePCR)technique for detection of cell-free circulating tumor DNA (ctDNA) in the blood plasma of cancer patients.Materials and Methods: Genomic DNA extracted from normal (wild-type) and thyroid cancer (mutant)cell lines (MCF10A and B-CPAP) were used to obtain specific dilution series (spike-in) of mutant DNAwith wild-type DNA. Two sequential PCR steps (regular and asePCR) were performed with specificallydesigned primers for each step to detect the spiked-in mutant DNA fraction within the wild-type normal DNA. The DNA products amplified by regular PCR were used as templates in the asePCR wherespecific reverse primers were designed to amplify either the mutant or wild-type allele while a common forward primer was covalently bound to the beads. The asePCR reaction mix was encapsulatedin water-in-oil emulsion compartments and incubated in a thermocycler with specific PCR programsettings. At the end of asePCR reaction, oil compartments were broken and DNA-coated beads wereevaluated by FACS to determine the mutant and wild-type fractions for each sample.Results: The asePCR technique successfully detected the mutant DNA in the background of wildtype DNA (0% mutant) as a proof-of-principle. A strong correlation (r2>0.99) was found between theexpected mutant fraction and the fraction measured by asePCR. asePCR was sensitive and specificenough to consistently detect various low mutant DNA fractions in the background of wild-type DNAwith no false positives in the wild-type sample.Discussion and Conclusion: Our asePCR can be used to detect mutant ctDNA in the plasma of cancer patients as a liquid biopsy method for tumor response evaluation and early detection of possiblerelapses.

PDF

___

1. Mandel P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme. CR Acad Sci Paris. 1948;142:241–3.
2. Steinman CR. Free DNA in serum and plasma from normal adults. J Clin Invest. 1975;56(2):512–5.
3. Steinman CR, Ackad A. Appearance of circulating DNA during hemodialysis. Am J Med. 1977;62(5):693–7.
4. Steinman CR. Circulating DNA in systemic lupus erythematosus. Isolation and characterization. J Clin Invest. 1984;73(3):832–41.
5. Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 1977;37(3):646–50.
6. Lo YMD. Circulating nucleic acids in plasma and serum: an overview. Ann N Y Acad Sci. 2001;945(1):1–7.
7. Maire F, Micard S, Hammel P, Voitot H, Lévy P, Cugnenc P-H, et al. Differential diagnosis between chronic pancreatitis and pancreatic cancer: value of the detection of KRAS2 mutations in circulating DNA. Br J Cancer. 2002;87(5):551–4.
8. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am. 1990;262(4):56–61, 64–5.
9. Jones NL. PCR. Principles, procedures, and parameters. Methods Mol Biol. 2002;187:37–46.
10. Dressman D, Yan H, Traverso G, Kinzler KW, Vogelstein B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(15):8817–22.
11. Diehl F, Schmidt K, Choti MA, Romans K, Goodman S, Li M, et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med. 2007;14(9):985–90.
12. Vogelstein B, Kinzler KW. Digital PCR. Proc Natl Acad Sci. 1999;96(16):9236–41.
13. Karakas B, Qubbaj W, Al-Hassan S, Coskun S. Noninvasive digital detection of fetal DNA in plasma of 4-weekpregnant women following in vitro fertilization and embryo transfer. PLoS One. 2015;10(5):e0126501.
14. Cohen JD, Li L, Wang Y, Thoburn C, Afsari B, Danilova L, et al. Detection and localization of surgically resect able cancers with a multi-analyte blood test. Science. 2018;359(6378):926–30.
15. Diehl F, Li M, He Y, Kinzler KW, Vogelstein B, Dressman D. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat Meth. 2006;3(7):551– 9.
16. Higgins MJ, Jelovac D, Barnathan E, Blair B, Slater S, Powers P, et al. Detection of tumor PIK3CA status in metastatic breast cancer using peripheral blood. Clin Cancer Res. 2012;18(12):3462–9.
17. Day E, Dear PH, McCaughan F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 2013;59(1):101–7.