Mithat EVECEN, Serhat PABUCÇUOĞLU, İ. Kamuran İLERİ, Serhat ALKAN

The effect of various BSA levels in different media on development in vitro culture of mouse embryos

İki aşamadan oluşan bu çalışmada, iki hücreli fare embriyolarının in vitro kültüründe faklı BSA (bovine serum albumin) oranlarının ve medyumların etkisi araştırıldı, iki hücreli fare embriyoları birinci aşamada (1400 adet), çeşitli oranlarda BSA içeren iki farklı medyumda 96 saat süreyle kültüre edildi ve ardından gelişim düzeyleri direkt mikroskobik bakı ile kontrol edildi, ikinci aşamada ise 1024 adet iki hücreli fare embriyosu aynı süreyle kültüre edildi ve boyama teknikleri kullanılarak embriyoların gelişim devreleri ve hücre sayıları (hücre çekirdek sayıları) kontrol edildi. Embriyolar her iki aşamada, M 16 ve Whitren's medyumlarının O (kontrol), 0.3, 1, 3, 9, 18 ve 36 mg/ml miktarlarında BSA içeren gruplarında kültüre edildi. En yüksek blastosist oranı Whitten's medyumunun 3 mg/ml BSA içeren grubunda % 94,57 ± 7,43 olarak saptandı (P < 0,05). En yüksek hatching + hatched blastosist oranı % 67,70 ± 25,22 ile yine aynı grupta gözlendi. Çalışmanın ilk aşamasında M 16 medyumu için saptanan en yüksek gelişim oranı, 3 mg/ml BSA içeren grupta saptanmıştı. Oysa çalışmanın ikinci aşamasında, M 16 medyumu için belirlenen en yüksek hücre çekirdek sayısının (hücre sayısı) 1 mg/ml BSA grubunda olduğu (95,45 ± 9,61) ve bunun 3 mg/ml grubundaki değerden (81,37 + 18,31) daha üstün olduğu belirlendi (P < 0,05). Sonuç olarak denilebilir ki, iki hücreli fare embriyolarının in vitro kültüründe protein kaynağı olarak BSA'nın 1 ve 3 mg/ml dozlarda optimum derecede yararlı etkiler sağladığı ve kültür medyumu olarak gerek M 16 ve gerekse de Whitten's kültür medyumlarının başarılı bir şekilde kullanılabileceği söylenebilir. Fare embriyolarının gelişimsel muayenelerinde natif muayene yönteminin yanıltıcı sonuçlar verebildiği ve hücre boyama tekniğinin daha sağlıklı sonuçlar verdiği söylenebilir.

Fare embriyolarının in vitro kültüründe değişik medyumlardaki farklı BSA oranlarının gelişime etkisi

Various BSA (bovine serum albumin) levels and media effects on development of 2-cell stage mouse embryos in in vitro culture were investigated in this 2 stage study. In the first stage, 1400 2-celled mouse embryos were cultured in 2 various BSA-bearing culture media for 96 h and directly observed microscopically. In the second stage, 1024 2-celled mouse embryos cultured for the same period and cell numbers (nuclei of cells) were determined by staining techniques. Embryos were cultured in both stages in M 16 and Whitten's media containing 0 (control), 0.3, 1, 3, 9, 18 and 36 mg/ml of BSA. The highest blastocyst rate was 94.57% ± 7-43, observed in 3 mg/ml BSA-containing Whitten's medium group (P < 0.05). The highest hatching + hatched blastocyst rates were obtained in the same group with 67.70% ± 25.22. The highest nucleus number in the M 16 medium was in the 1 mg/ml BSA group (95.45 ± 9.61). In the M16 medium group, the 3 mg/ml BSA group showed the highest development rate in the first stage of the study; however, the nucleus numbers in this group (81.37 ± 18.31), were significantly lower than the nucleus numbers of the 1 mg/ml BSA group (P < 0.05). It was concluded that the optimal benefit to in vitro culture of 2-cell mouse embryos could be maintained when BSA was used as a protein source at 1 mg/ml and 3 mg/ml doses, and that M16 or Whitten's media could be used successfully as a culture medium. Developmental evaluations of in vitro cultured mouse embryos could be confusing when only the native route was employed, and a staining technique could give more reliable results.

PDF

___

1. Hogan, B., Costantini, F., Lacy, E.: Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. 1986; Cold Spring Harbor Laboratory. New York.
2. Millham, C.N., Tornesi, M. B., Palasz, A.T., Archer, J.: Effect of Donor Bovine Serum Fractionation on Preimplantation Mouse Embryos in Culture. Theriogenology, 1994; 41; 257, (Abstr.).
3. Pike, I.L., Alikani, M.: Time Dependent Loss of Development Potential When Two-Celled Mouse Embryos Were Retained in Culture in Excised Oviducts. Ann. New York Acad. of Sci., 1988; 541:419-423.
4. Brinster, R.L.: Studies on the Development of Mouse Embryos in Vitro. The Effects of a Fixed Nitrogen Source. J. Exp. Zool., 1965; 158: 69-77.
5. Kraemer, D.C., Bowen, M.J.: Embryo Transfer in Laboratory. Animals. In: Current Therapy in Theriogenology (ed. D. A. Morrow). 1986; Philadelphia, W. P. Saunders Co. 73-76.
6. Brinster, R.L.: A Method for ln-Vitro Cultivation of Mouse Ova from Two-Cell to Blastocyst. Exp. Cell Res., 1963; 32: 205-208.
7. Chatot, C.L., Ziomek, C.A., Bavister, B.D., Lewis, J.L., Torres, I.: An Improved Culture Medium Supports Development of Random- Bred 1 -Cell Mouse Embryos ln-Vitro. J. Reprod. Fert., 1989; 86: 679-688.
8. Mehta, T.S., Kiessling, A.A.: Development Potential of Mouse Embryos Conceived ln-Vitro and Cultured in Ethylenediaminetetraacetic Acid with or without Amino Acids or Serum. Biol. Reprod., 1990; 43: 600-606.
9. Saito, H:, Berger, T., Mishell, D.R. Jr., Marrs, R.P.: Effect ofl Variable Concentration of Serum on Mouse Embryo Development. I Fertil. Steril., 1984; 41: 460-464.
10. Shirley,B., Wortham, J.W.E., Witmyer, J., Mahony, M.C., Forttl G.: Effects of Human Serum and Plasma on Development of Mouse Embryos in Culture Media. Fertil.Steril., 1985; 43: 129-134.
11. Tornesi, B., Palasz, A.T., Tan, L, Campo, D.L.R., Rousseaux, C.G. Mapletoft, R.J.: The Effect of Concentration of Different Sera on Mouse Embryos and Limb Buds in Culture. Therigenology, 1992; 37; 310 (Abstr.).
12. Tornesi, B., Palasz, A.T., Campo, D.L.R., Rousseaux, C.G., Archer, F.J., Mapletoft, R.J.: In vitro culture of preimplantation mouse embryos and day 12 limb-buds. Reproduct. Toxicol., 1993; 7: 623-630.
13. Hsu, Y.C.: Embryo Growth and Differentiation Factors in Embryonic Sera of Mammals. Dev. Biol., 1980; 76: 465-474.
14. Willey, L.M., Yamami, S., Muyden, D.V.: Effect of Potassium Concentration, Type of Protein Supplement and Density on Mouse Preimplantation Development In Vitro. Fertil. Steril., 1986; 45: 111-119.
15. Butler, J.E., Biggers, J.D.: Assessing the Viability of Preimplantation Embryos in-Vitro. Theriogenology, 1989; 31: 115-125.