Aslinur SİRCAN-KUCUKSAYAN, Ertan KUCUKSAYAN

Geri Yansıma Spektroskopisi ile Hücre Kültürü Çalışmalarında Hücre Sayısının Belirlenmesi İçin Yeni Bir Metot

Giriş: Hücre kültürü çalışmaları hastalıkların teşhis ve tedavisine yönelik çalışmalar ve ilaç araştırmaları gibi pek çok alanda kullanılan önemli bir in vitro deney modelidir. Hücre kültüründe yapılan çalışmalarda; hücre sayımı sıklıkla tekrarlanan ve deneylerin standardizasyonu ve/veya optimizasyonu için önemli bir süreç olarak kabul edilmektedir. Hücre sayımı otomatik hücre sayım cihazları ile yapılabilmektedir ancak bu tür cihazlar yüksek maliyet ve hücre kayıpları gibi dezavantajlara sahiptir. Hücre sayımı için yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem ise hemositometredir. Bu yöntemde hücre sayım işlemi manuel olarak yapıldığından uzun süreli çalışmalarda, sayımın doğruluğu araştırmacının dikkatine bağlı olması dolayısıyla, hata oranı artabilmektedir. Hücre sayısını belirlemenin en ideal yolu hücrelerin ortamlarını değiştirmeden, önemli ölçüde pH veya sıcaklık değişimi yaratmadan hızlı ve doğru ölçüm yapabilmektir. Bu çalışmanın amacı hücre kültürü deneylerinde hücre sayısını belirlemek için geri yansıma spektroskopisi kullanarak ile yeni bir yöntem geliştirmek. Materyal-Metot: Bu çalışmada, spektrometre, tungsten-halojen ışık kaynağı ve fiber optik probtan oluşan bir deney düzeneği kullanıldı. Işık fiber optik probun kaynak fiberleri ile numuneye gönderilir, numuneyle etkileştikten sonra geri yansıyan ışık fiber optik probun dedektör fiberleri ile toplanır ve spektrometreye gönderilerek Dalga boyuna bağlı ışık şiddeti spektrumu elde edilir. Bu spektrumun analizi ile numunelerdeki hücre sayısı belirlenebilir. Bunun için A375 malin melanoma hücreleri standart hücre kültürü tekniği ile çoğaltıldı. Hücreler tripsin ile flasktan kaldırılıp hücre sayım cihazı ile sayıldı. Son hacim 1 ml olacak şekilde farklı hücre sayısı (0-32.5x105) aralığında toplam 10 numuneden ışık şiddeti ile hücre sayısı arasındaki ilişkiyi belirlemek için ölçümler yapıldı. Aynı yöntemle son hacim 1 ml olacak şekilde (5-30x105) hücre sayısı aralığında toplam altı numuneden daha ışık şiddeti ile hücre sayısı arasında belirlenen ilişkiyi test etmek için ölçümler yapıldı. Bulgular: Farklı hücre sayılarındaki numuneler için dalga boyuna karşı ışık şiddeti spektrumları elde edildi ve spektrumların hücre sayısına bağlı olarak değiştiği belirlendi. Bu spektrumlardan elde edilen K (450-700 nm) parametresine karşı hücre sayısını veren bir kalibrasyon grafiği bulundu. Bu yöntem ile numunelerin hücre sayılarının %1.9-6.5 arasındaki hata oranları ile belirlendi. Sonuç: Bu çalışmada fiber optik prob ile dalga boyuna bağlı geri yansıma ölçümleri yapılarak hücre kültürü koşullarına minimum müdahale ederek hücre sayısını gerçek zamanlı belirleyebilen yeni bir yöntem geliştirildi. Bu yöntem hücre sayısının zamana bağlı izlenmesine olanak veren invazif olmayan, objektif, tekrarlanabilir ve tecrübe gerektirmeyen bir teknik olarak geliştirilme potansiyeli vardır.

Anahtar Kelimeler:

Hücre kültürü, Hücre sayımı, Fiber Optik Prob, Geri Yansıma Spektroskopisi

A NEW METHOD FOR DETERMINING THE NUMBER OF CELLS BY BACK REFLECTION SPECTROSCOPY IN CELL CULTURE STUDIES

Objective: Cell culture studies are an important in vitro experimental model used in many fields such as studies for diagnosis and treatment of diseases and drug research. In studies cell culture; cell count is often repeated and is considered an important process for standardization and / or optimization of experiments. Cell counting can be done with automatic cell counting devices, but such devices have disadvantages such as high costs and cell losses. Another commonly used method for cell counting is the hemocytometer. In this method, since cell counting is done manually, in long-term studies, the error rate may increase as the accuracy of the count depends on the researcher's attention. The ideal way to determine the number of cells is to be able to measure quickly and accurately without changing the environment of the cells and creating a significant pH or temperature change. The aim of this study is to develop a new method with using back reflection spectroscopy to determine the number of cells in cell culture experiments. Material-Method: In this study, we used an experiment set consisting of spectrometer, tungsten-halogen light source and fiber optic probe. We sent the light to the sample with the source fibers of the fiber optic probe, after interacting with the cell samples, the reflected light was collected with the detector fibers of the fiber optic probe and sent to the spectrometer. We obtained the light intensity spectrum depending on the wavelength. The number of cells in the samples was determined by analyzing this spectrum. For this, we propagated A375 malignant melanoma cells by standard cell culture technique. Cells were removed from the flask with trypsin and counted with a cell count device. Measurements were made to determine the relationship between the light intensity and the number of cells from a total of 10 samples in the range of different cells (0-32.5x105) with a final volume of 1 ml. With the same method, measurements were made to test the relationship between the light intensity and the number of cells than a total of six samples in the range of (5-30x105) cells, with a final volume of 1 ml. Results: For samples with different cell numbers, light intensity spectra versus wavelength were obtained and it was determined that the spectra changed depending on the number of cells. A calibration graph was found that gives the number of cells against the K (450-700 nm) parameter obtained from these spectra. With this method, cell numbers of samples were determined with error rates between 1.9-6.5%. Conclusions: In this study, a new method has been developed that can determine the number of cells in real time by minimum interference to cell culture conditions by making back reflection measurements based on wavelength with fiber optic probe. This method has the potential to be developed as a non-invasive, objective, reproducible and inexpensive technique that allows time-based monitoring of the number of cells.

Keywords:

Cell culture, Cell count, Fiber Optic Probe, Back Reflection Spectroscopy,

PDF

___

1. Antoni D, Burckel H, Josset E, Noel G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in Vivo. International Journal of Molecular Sciences. 2015;16(3):5517-27. 2. Hudu SA, Alshrari AS, Syahida A, Sekawi Z. Cell Culture, Technology: Enhancing the Culture of Diagnosing Human Diseases. J Clin Diagn Res. 2016;10(3):DE01-5. 3. Kucuksayan E, Cort A, Timur M, Ozdemir E, Yucel SG, Ozben T. N-acetyl-L-cysteine inhibits bleomycin induced apoptosis in malignant testicular germ cell tumors. Journal of cellular biochemistry. 2013;114(7):1685-94. 4. Kucuksayan E, Konuk EK, Demir N, Mutus B, Aslan M. Neutral sphingomyelinase inhibition decreases ER stress-mediated apoptosis and inducible nitric oxide synthase in retinal pigment epithelial cells. Free radical biology & medicine. 2014;72:113-23. 5. Hanikoglu A, Kucuksayan E, Hanikoglu F, Ozben T, Menounou G, Sansone A, et al. Effects of Somatostatin and Vitamin C on the Fatty Acid Profile of Breast Cancer Cell Membranes. Anti-cancer agents in medicinal chemistry. 2019;19(15):1899-909. 6. Hanikoglu A, Kucuksayan E, Hanikoglu F, Ozben T, Menounou G, Sansone A, et al. Effects of somatostatin, curcumin, and quercetin on the fatty acid profile of breast cancer cell membranes. Canadian journal of physiology and pharmacology. 2020;98(3):131-8. 7. Hudu SA, Alshrari AS, Syahida A, Sekawi Z. Cell Culture, Technology: Enhancing the Culture of Diagnosing Human Diseases. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2016;10(3):De1-De5. 8. Davis JM. Basic Cell Culture: Oxford University Press; 2002. 9. Sircan-Kucuksayan A, Uyuklu M, Canpolat M. Diffuse reflectance spectroscopy for the measurement of tissue oxygen saturation. Physiol Meas. 2015;36(12):2461-9. 10. Bohren CF, Huffman DR. Absorption and Scattering of Light by Small Particles: WILEY‐VCH; 1998. 11. Bolin FP, Preuss LE, Taylor RC, Ference RJ. Refractive-Index of Some Mammalian-Tissues Using a Fiber Optic Cladding Method. Applied Optics. 1989;28(12):2297-303. 12. Mourant JR, Freyer JP, Hielscher AH, Eick AA, Shen D, Johnson TM. Mechanisms of light scattering from biological cells relevant to noninvasive optical-tissue diagnostics. Applied Optics. 1998;37(16):3586-93. 13. Sircan-Kucuksayan A, Canpolat M. Retrieval of Chromophore Concentration in a Tissue Phantom by Diffuse Reflectance Spectroscopy. Optics and Spectroscopy. 2014;117(4). 14. Karakas BR, Sircan-Kucuksayan A, Elpek OG, Canpolat M. Investigating viability of intestine using spectroscopy: a pilot study. Journal of Surgical Research. 2014;191(1):91-8. 15. Turhan M, Yaprak N, Sircan-Kucuksayan A, Ozbudak I, Bostanci A, Derin A, et al. Intraoperative assessment of laryngeal malignancy using elastic light single-scattering spectroscopy: A pilot study. Laryngoscope. 2017;127(3):611-5. 16. Duval K, Grover H, Han LH, Mou Y, Pegoraro AF, Fredberg J, et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology (Bethesda). 2017;32(4):266-77. 17. Gurbuz N, Asoglu MR, Ashour AA, Salama S, Kilic GS, Ozpolat B. A selective serotonin 5-HT1B receptor inhibition suppresses cells proliferation and induces apoptosis in human uterine leiomyoma cells. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. 2016;206:114-9. 18. Erdoğan MA, Taşkıran D. Rotenon ile İndüklenen İn Vitro Parkinson Hastalığı Modelinde Glukagon Benzeri Peptid-1 Analoğu Ekzenatidin Nöron Sağkalımına Etkisi. Sdü Sağlık Bilimleri Dergisi. 13.10.2019;10(4):362-268. 19. Huang DC, Hung KD, Chan YK. A computer assisted method for leukocyte nucleus segmentation and recognition in blood smear images. Journal of Systems and Software. 2012;85(9):2104–18. 20. Ozkan A, Isgor SB, Tora H, Uyar P, Iscan M, editors. An alternative method for cell counting. Signal Processing and Communications Applications Conference; 2011; Turkey: IEEE 21. Özkan A, İşgör BS, Şengül G, editors. Method proposal for distinction of microscope objectives on hemocytometer images. Signal Processing and Communication Application Conference; 2016; Turkey: IEEE. 22. Szabo SE, Monroe SL, Fiorino S, Bitzan J, Loper K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 2004;10(2):109-11. 23. Chen A, Leith M, Tu R, Tahim G, Sudra A, Bhargava S. Effects of diluents on cell culture viability measured by automated cell counter. PLoS One. 2017;12(3):e0173375.