SEDAT HAMDİ KIZIL, TAHİR KARAŞAHİN, Muharrem SATILMIŞ, NUMAN AKYOL

Etilen Glikol ile Direkt Transfer Metoduna Göre Dondurulan in vivo Sığır Embriyolarının Transferi

Bu çalışmanın amacı, etilen glikol direkt transfer metoduna göre dondurulan in vivo sığır embriyolarının taşıyıcı hayvanlara nakledilerek gebelik elde edilmesidir. Projenin ilk aşamasında; 56 adet iyi kalite in vitro üretim sığır embriyosu etilen glikol direkt transfer metoduna göre dondurulmuştur. Çözündürme sonrası TCM-199 + 0.1mM β-merkaptoetanol + %10 fötal buzağı serumu (FCS) içeren solüsyon içerisinde, 24-48 saat inkubasyonda, 36 adet embriyonun re-ekspansiyonu ve zonadan çıktığı görülmüş, canlılık oranı %64.28 olarak tespit edilmiştir. İkinci aşamada; süperovulasyon protokolü uygulanan kültür ırkı ineklerden 8 adet iyi kalite embriyo toplanmıştır. Embriyolar 1.8M etilen glikol + 0.1M sakkaroz içeren %20 yeni doğmuş buzağı serumlu (CS) Dulbecco’nun fosfat tampon solüsyonu (D-PBS) içerisine alınarak 0.25 ml’lik steril payetlere çekilmiştir. Yerleştirme her bir payete bir embriyo olacak şekilde yapılmış ve payetler oda sıcaklığında 15 dk. ekilibrasyona bırakılmıştır. Programlanabilir dondurma cihazının, metil alkol bulunan haznesi içerisine payetler yerleştirilerek, -7oC’den itibaren soğutma işlemine başlanmıştır. -7oC’de 2 dk. sonra payetlere seeding yapılmış ve 8 dk aynı ısıda bekletilmiştir. Soğutma işlemine -30oC’ye kadar 0.3oC/dak. düşürülecek şekilde devam edilmiş ve direkt -196oC‘deki sıvı azot içerisine alınarak embriyolar muhafaza altına alınmıştır. Çözündürmede, sıvı azot içerisinden alınan payet önce 5-6 sn. havada tutulmuş, 30oC’deki su banyosunda 10 sn. tutularak çözdürülmüştür. Önceden prostaglandin F2α ile senkronize edilen 8 baş taşıyıcı inekte kızgınlığının yedinci gününde rektal palpasyon ile korpus luteum (CL) tespiti yapılmıştır. CL tespit edilen taşıyıcılara, kriyoprotektan uzaklaştırılmadan embriyolar, cerrahi olmayan yöntemle, ipsilateral olarak nakledilmiştir. Nakil sonrası 60. günde taşıyıcı hayvanların rektal palpasyon ile yapılan gebelik kontrollerinde, 5 taşıyıcı hayvanın gebe olduğu tespit edilmiş ve gebelik oranı %62.5 olarak bulunmuştur. Gebeliklerin hepsi doğumla sonuçlanmıştır. Bu çalışmada, kriyoprotektan olarak etilen glikol’ün sığır embriyolarının dondurulması ve direkt transferinde kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.

Anahtar Kelimeler:

embriyo kültürü, blastosist, inek, donma, dondurarak koruma, embriyo nakli, in vitro, embriyo, etilen glikol, in vitro kültür, metodoloji, gebelik, yaşayabilme, teknikler, sığır

Transfer of in vivo Embryos Frozen by Direct Transfer Method with Ethylene Glycol in Cattle

The aim of this study was to be obtained pregnancy after the transfer of in vivo cattle embryos frozen by direct transfer method with ethylene glycol. First of all, 56 in vitro produced cow embryos of good quality were frozen by direct transfer method with ethylene glycol. After thawing, embryos were transferred into TCM-199 + 0.1 mM β-mercaptoethanol + 10% foetal calf Serum (FCS) medium to check in vitro survival at 24-48 h. The re-expansion and hatching rate of blastocysts was 64.28% (36 blastocysts). At the second stage; 8 good quality embryos were collected from superovulated culture breed cows. Embryos were equilibrated for 15 min in room temperature in 1.8M ethylene glycol + 0.1M sucrose in dulbecco’s phosphate buffered saline (D-PBS) supplemented with 20% newborn calf serum (CS). Embryos were then loaded individually into a 0.25 ml straw and placed directly into a cooling chamber of a programmable freezer with methyl alcohol precooled to -7°C. After 2 min, straw was seeded, maintained at -7°C for 8 min more, and then cooled to -30°C either at 0.3°C/min before being into liquid nitrogen. The frozen embryos were thawed by allowing the straw to stand in air for 5 to 6 sec and then immersing them in a 30°C water bath. Embryos frozen-thawed in the presence of EG were nonsurgically transferred into the uterine horn into the recipient without diluting the cryoprotectant. Synchronized recipient cows with prostaglandine F2α were received one embryo each in the horn ipsilateral to the corpus luteum (CL). Pregnancies were diagnosed by rectal palpation 60 days after embryo transfer. Eight frozen-thawed embryos were transferred directly to eight recipients and five recipients gave birth to five normal calves. The pregnancy rate was 62.5%. This result indicated that EG can be used effectively for cattle embryo freezing and transfer as a suitable cryoprotectant.

Keywords:

embryo culture, blastocyst, cows, freezing, cryopreservation, embryo transfer, in vitro, embryos, ethylene glycol, in vitro culture, methodology, pregnancy, survival, techniques, cattle,

PDF

___

Kasai M: Vitrification: Refined strategy for the cryopreservation of mammalian embryos. J Mamm Ova Res, 14, 17-28, 1997.
Ohboshi S: Cryopreservation of mammalian embryos by vitrification. Anim Sci Tech, 69, 1069-1077, 1998.
Kasai M: Simple and efficient methods for vitrification of mammalian embryos. Anim Reprod Sci, 42, 67-75, 1996.
Miyamoto H, Ishibashi T: Survival of frozen-thawed mouse and rat embryos in the presence of ethylene glycol. J Reprod Fert, 50, 373-375. 1977.
Voelkel SA, Hu YX: Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females. Theriogenology, 37, 687-697, 1992.
Akyol N, Kızıl SH, Tuncer PB: İneklerde süperovulasyon ve embriyo transferi çalışmaları. Lalahan Hay Araşt Enst Derg, 44 (1): 1-5, 2004.
Köse M, Dursun Ş, Bülbül B, Kırbaş M: İsviçre Esmeri ineklerde FSH ile süperovulasyon ve embriyo transferi çalışmaları. Hayvancılık Araştırma Dergisi, 16 (1): 1-6, 2006.
Sungur H, Yurdaydın N: Sığır embriyosunun dondurulması ve transferi. Lalahan Hay Araşt Enst Derg, 34 (1-2): 1-24, 1994.
Riha J, Machatkova M, Pavlok A: Viability of fresh and frozen transferred IVP bovine embryos. Czech J Anim Sci, 47, 261-267, 2002.
Sakakibara H, Takagi M, Yamamoto M, Ooe M, Suzuki T: Efficacy of methyl cellosolve as a cryoprotectant for cryopreservation of bovine embryos. J Reprod Dev, 42, 15-20, 1996.
Suzuki T, Takagi M, Yamamoto M, Boediono A, Saha S, Sakakibara H, Oe M: Pregnancy rate and survival in culture of in vitro fertilized Bovine embryos frozen in varios cryoprotectants and thawed using a one step system. Theriogenology, 40, 651-659, 1993.
Yamashina H: Pregnancy rates and uterine-horn positions for transfer of frozen-thawed bovine embryos. J Japan Vet Med Assoc, 55, 719-722, 2002.
Bülbül B, Dursun Ş, Kırbaş M, Köse M, Ümütlü S: Düvelerde embriyo transferi öncesi flunixin meglumin uygulamasının gebelik oranı üzerine etkisi. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 16 (1): 105-109, 2010.
Sungur H, Alaçam E, Tekeli T, Kadak R, Pakdil N, Whitager RO: İsviçre Esmeri düvelerde dondurulmuş embriyo nakli uygulamaları. Lalahan Hay Araşt Enst Derg, 29 (1-4): 80-89, 1989.
Dochi O, Imai K, Takakura H: Birth of calves after direct transfer of thawed bovine embryos stored frozen in ethylene glycol. Anim Reprod Sci, 38, 179-185, 1995.
Yamashina H: Pregnancy or abortion rates and quality of frozen-thawed bovine embryos imported from North America or Europe. Japanese J Large Anim Clinics, 25, 11-16, 2002.
Wurth YA, Reinders JMC, Rall WF, Kruip T: Developmental potential of in vitro produced bovine embryos following cryopreservation and single-embryo transfer. Theriogenology, 42, 1275-1284, 1994.
Lopatarova M, Cech S, Holy L, Dolezel R: The effect of vitrification in open pulled straws on pregnancy rates after transfer of in vivo produced bovine embryos. Vet Med, 51, 454-460, 2006.
Dochi O, Yamamoto Y, Saga H, Yoshiba N, Kano N, Maeda J, Miyata K, Yamauchi A, Tominaga K, Oda Y, Nakashima T, Inohae S: Direct transfer of bovine embryos frozen-thawed in the presence of propylene glycol or ethylene glycol under on-farm conditions in an integrated embryo transfer program. Theriogenology, 49, 1051-1058, 1998.
Martinez AG, Brogliatti GM, Valcarcel A, De Las Heras MA: Pregnancy rates after transfer of frozen bovine embryos a field trial. Theriogenology, 58, 963-972, 2002.