BHK- 21 Hücre Dizisi % O.S Lactalbumin hydrolysate, % 0.01 Yeast extr-act ve % 10 Sığır serumu .ihtiva eden Hanks' Dengeli Tuz Soh.ısyonu (HYL) içinde önce manolayer sabit hücre kültürlerinde tiretilmiştir. Vasattan Yeast extract ' çıkarıldığında BHK- 21 · hücresini üretmek mümkün olamamış ve BHK hücresinin HYL ı vasatında üretilmesinde Yeast extract ilavesinin şart olduğu anlaşılmıştır. Manolayer üremeye adapte olmuş hücre Bellco cihazı ve New Brunswick fermentörleri~1de seri pasajlar yapı~arak . suspansiyon kültürüne adapte edilmiştir. Susparisiyon hücre kültürü çalışmalaı ·ında, üremenin 24. cü saatinde vasat % 1 Tryptose Phosphate Broth ile takviye edilmiştir. New Brunswick fermentörlernide pH . ayarlaması 24. cü saatten itilxiren 300 cc/ dakika superfisiyal steril· hava verilerek yapılmıştır. Suspansiyon ~ültürü çalışmalarında başlangıç hücre sayısı 1.0- 1.2 X lOS /ml olduğu haller de, 48 saate, 2- 3 misli çoğalma elde eelilmesine rağmen, 5.0 X 104 hücre/ml ile başlandığında ortalama 5 misli üreme elde edilmiştir. Başlangıç hücre· sayısının fazla olduğu birinci durumda 24. cü saatten itibaren pH kontrolü ele güçleşmiştir. Halbuki, 5.0 x 104 hücre/ml ile başlandığında superfisiyal hava vermekle pH .7.2 -7.4 arasında tutulabill!lektedir. Rolling sistemde kültür hazırla,nabilmesi için enkubasyonun 48. ci saatinde toplanan hÜcre suspansiyonu bir gece + 4 oc de bekletilerek hücreler dibe çöktürülmüş, ertesi günü, üstteki mayi aıılarak, dibe çöken hücreler % 10 sığır -serumlu HYL vasatında W.OOO hücre/ ml olacak şekilde sulandırılmış, 1 litre kapasiteli yuvarlak şişelere 150 ml tevzi edilerek rolling sistem etüvüne koyulmuştur. Hücrenin üreyip şişe sathını tamamen kaplaması 3 gün içinde olmaktadır. Bunu takiben şişelerdeki vasat boşaltılmış ve 0.1 TCDso virus/hücre olacak şekilde (Dana böbreğii1e veya BHK hücresine 5-6 pasajcia adapte olmuş virus) virus ilave edilen HYL vasatından herbir şişeye 100 ml konularak enfeksiyonun 30. cu saatinde toplanmıştır. Bu anda hücreler şişe satlımdan tamamen kalkmış bulunmaktadır. Aşı istihsalinde kullanılacak bu virus önce % ı nisbetinde chloroform'la karıştınlıp bir gece + 4 oc de bekletilerek, ertesi gün, 10.000 rpm de santrifüj edilmiş; aynı işlem ikinci defa % 0.6 nisbetinde chloroform'la tekrarlanmıştır. Aşı hazırlanmadan evvel ayrıca , Seitz K- S klarifiye filtre kağıdından süzülmüştür. Virusun BHK hücresinde enfektivite titresi CPE test'i ile, areton ı B le muamele4en önce, (AT) ve sonra (ATAT) antij~nik titreleri de semi- kantitatif complement- fixation test' i ' ile ' yapılmıştır. 5 ml lik sığır aşı dozuna 2 ml virus ilave edilmiştir. Aşılar formulle inaktive olup, adjuvant olarak sapanin kullanılmıştır. Virusun enfektivite ve antijenik titreleri ile eprüvasyon sonuçları çok tatminkar olup, (Tablo : ı) de gösterilmiştir

BHK- 21 cell was first grown in manolayer stationary cultures using Hanks' BSS cont8ining 10% bovine serum, 0.01 % yeast extract, and ·0.5% lactalbumin hydrolysate (HYL). These cells did not grow in Hanks' lactalbuınin medium without yeast extract. So yeast extract must be considered as an essential part for BHK cell development in Hanks' lactalbumin medium. BHK- 21 cell adapted to manolayer culture was then serially passed in Bellco apparatus and in New Brunswick fermentors to adapt to suspension culture. HYL medium was supported with 1 % tryptose phosphate 1Jroth added at the 24 th hour of culture. The pH of the suspension, in New Brunswick fermentors, was adjusted with sterile air on the surface, after 24 hour of incubation, at the ratio of 300 cc/minute. When the initial cell count was 1.0 to 1.2 X 10'/ml, the cells increased only 2- 3 times, but when the initial cell number was only 5.0 X HY1 /ml the increase was an average of 5 times. In the first case, when initial cells were more concentrated, the pH was difficult to regulate at the second day of incubation, whereas, in the later case with the addition of air on the surface, the pH between 7.2-7.4 was easier. The cell suspension was harvested at the 48 th hour of ineuhation and left overnight at + 4 ·c for sedimentation. To carry out the rolling flask manolayer cell culture, the supernatant of suspended cell culture was decanted, and the cells were diluted to 50.000/ml in HYL medium containing ıo %' bovine serum, then ıso ml put into each ı litre capacity rolling flask and placed in the incubator. The confluency ·of the cells was almost 100% on the 3 rd day. For virus culture, the growth medium is removed and replaced with 100 ml of HY~, without serum, containing virus (either calf kidney virus or virus adapted With 5-6 passages to BHK cells) in amount of o.ı TCDso/cell. , The virus was harvested at the 30 th hours of infection. At this time, there was a nearly complete lysis of cellular monolayer. This vaccine virus was then treated with ı % chloroform and kept overnight at + 4 ·c; the next morning it was centrifuged at 10,000 rpm in a Westfalia separator, the same treatment was repeated with 0.6% chloroform. The virus was then filtered through Seitz K- 5 clarifying filter pad. Infectivity titer of the virus was carried out on the BHK cell c.ultures grown in tubes according to the CPE of the ·virus, antigenicity before (AT) and after areton 113 treatment (ATAT) were determined by semi- quantitative complement- fixation test. S ml cattle dose of vaccine contained 2 ml of virus. The vaccines were formalin inactivated at 26 ·c ·for 48 hours and contained saponin as adjuvant. The infectivity· and antigenic titers of vaccine viruses and the results of vaccine challenges were very satisfactory as shown in (Table : 1)